基因工程2013的学习教案.pptxVIP

基因工程2013的学习教案;基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。 基因克隆 将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。 基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。; 本章主要内容 重要的工具酶 基因克隆常用的载体 重组DNA基本原理 重组技术在医学和制药 工业中的应用;第一节 重要的工具酶;一、限制性核酸内切酶(RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶的作用特性，一般分为三类： ——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型， 其中常用的是Ⅱ型限制酶。 ;6; 限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点 特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口： 5ˊ－粘性末端 3ˊ－粘性末端 平端或钝端 回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称; 粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的碱基序列相互具有互补性。;⑴ 产生5-粘性末端; ⑶ 产生平(头末)端/钝端;同裂酶 ;同裂酶——同识同切;同裂酶——同识异切;同 尾 酶;可变酶; 常用限制性核酸内切酶的特性;二、DNA聚合酶; ㈠ DNA聚合酶Ⅰ ; DNA pol Ⅰ应用;E. coli DNA pol. Ⅰ催化切口平移;㈡ Klenow片段（DNA pol.大片断）; Klenow片段用途; ㈢ Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）;三、逆转录酶; 逆转录酶的应用： ⑴ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； ⑵ 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段； ⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析； ⑷ 制备杂交探针等。;四、DNA连接酶(DNA ligase) ;五、碱性磷酸酶 ;六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT) ;重要的工具酶;第二节 基因克隆常用的载体;一、载体必须具备的基本条件;二、载体的种类*;三、常用的载体 ; 总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。 广泛应用的质粒： pBR32质粒、pUC系列等; pBR322质粒;;; λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长（lytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长(lysogenic pathway) 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。;; 第三节 重组DNA基本原理;1、获取;2、重组;3、转化;4、筛选;5、克隆;6、表达;一、目的基因的获取（分）;（一）制备基因组DNA（基因文库） 分离、纯化基因组DNA 条件：温和，在EDTA或SDS等存在下 ↓RE 用蛋白酶K消化细胞、酚抽提 大小不同酶切片段 片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离 ↓ 分别与同样RE消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 ↓ DNA连接酶连接。 导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。 ↓ 筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳 等方法鉴定。 ;（二）制备cDNA （cDNA文库）;（二）制备cDNA （cDNA文库）;（三）聚合酶链反应( PCR); 二、 目的基因与载体的连接（接） （主要有以下4种连接方式） 1)