蛋白质或多肽的放射性标记及分析方法.pptxVIP

蛋白质或多肽的放射性标记及分析方法;二、15N,14N标记E.Coli繁殖实验证明双链DNA具有半保留的复制机制 1957年，Meselson-Stahl用放射性标记技术，实验证明了Watson与Crick提出的双链DNA半保留复制理论。在半保留复制中，亲本双链DNA的两条链分开，它们根据碱基配对原则各自以自己为模板，选取适当的碱基组成两条子代双链，完成复制过程。实验是这样进行的：先使细菌培养物(E．Coli)在以15N标记的15NH4C1为唯一氮源的培养基中生长许多代，使DNA分子都标记上重同位素15N。再把细胞转移到含普通同位素15N的培养基上。在转移后不同时间收集细胞样品，提取DNA并作CsCl密度梯度离心。结果发现有密度介于重的[15N，14N]和轻的[15N，14N] DNA之间的杂化分子[15N，14N] DNA出现。这种杂化分子随着培养时间的增加逐渐增多。当培养到E．Co1i繁殖第一代的时间时，杂化分子成为主要成分。尔后即有轻的[15N，14N] DNA分子出现。当培养到E．Coli第二代时，杂化DNA与轻DNA各占一半。取杂化DNA分子在100℃下作热变性处理后于CsCl中离心，可以出现两条区带，它们分别为[14N]单链DNA和[15N]单链DNA。Meselson-Stahl实验证实了E.Coli繁殖中，亲代DNA分为两条单链，各自成为子代双链DNA的模板，双链DNA具有半保留复制机制。 ;第3页/共55页;三、32P标记分子杂交实验证明遗传信息从DNA到mRNA的转录 Spiegelman利用人工合成RNA-DNA杂种分子的实验证明RNA分子的核苷酸顺序由DNA转录决定，RNA分子的生物信息来自DNA。把双链DNA加热，使产生单链DNA分子，若在热溶液逐渐冷却过程中加入与该DNA链互补的单链mRNA，则在形成复性DNA分子的同时会有DNA-RNA杂种分子形成。形成杂种分子的条件是这种RNA分子的核苷酸顺序与DNA分子中某些核苷酸顺序互补。利用这个原理，可以鉴别RNA与DNA碱基顺序是否有互补的特性。实验也可采用放射性标记技术进行。将T4噬菌体感染的大肠杆菌(E．Coli)放在含32PO43－的培养基中培养，提取32P标记的RNA，将32P-RNA分别加到E．Coli的DNA热溶液和T4噬菌体的DNA热溶液中，溶液慢慢冷却后上膜过滤，除去游离RNA，测量膜上物质的32P放射性活度。结果发现加到T4 DNA溶液中的32P-RNA大部分已和T4 DNA形成杂交分子并留在膜上，而加到E．Coli DNA溶液中的32P-RNA很少与E．Coli DNA形成杂交分子因此很少留在膜上。这个实验证明了感染后合成的RNA和噬菌体DNA的碱基顺序互补，前者的碱基顺序由后者决定，同时感染后合成的RNA并下与宿主细胞DNA互补。这个结果和关于噬菌体DNA是合成噬菌体mRNA的模板这一早期推测完全一致。 ;四、3H-亮氨酸标记网织红血球培养实验证明多肽链合成起始于氨基末端 多肽链是从氨基末端还是从羧基末端开始延伸的，Dintzis的放射性标记实验作出了回答。把网织红血球加3H标记的亮氨酸3H-Leu作体外培养，蛋白质合成后分离提取出新合成的血红蛋白，分析该蛋白肽链中的放射性分布。实际上，如果培养的时间相对较长时(如3min)，那么在合成的肽链中，有一些是在加入3H-Leu前已接近完全合成的，这些肽链中只在远离生长点的地方有3H-Leu；另一些肽链是在加入3H-Leu后才开始合成的，这些肽链几乎整条链上都分布有3H-Leu还有更多的肽链一段在3H-Leu加入前另一段在3H-Leu加入后合成，且长短不一。这样，血红蛋白链有如图7-2所示的3H-Leu分布。如果培养的时间很短(如30s)，则只有在3H-Leu加入前已经合成了某一片段的那些链，才有可能完成整个链的合成。故靠近某一端的3H-Leu放射性比另一端强许多(图7-2 H p448)且有一定的梯度分布。实验表明，血红蛋白肽链中靠近氨基末端的放射性比活度最低，靠近羧基末端的则最高，从而证明肽链的合成是由氨基端到羧基端的方向延伸的。 ;第6页/共55页;五、14C标记氨酰基—tRNA对三联体遗传密码的研究 蛋白质是一类按一定顺序排列起来的氨基酸所组成的多肽结构，它的生物合成过程是mRNA密码信息经核糖体解译的转译过程。放射性标记实验技术在了解这个遗传密码的解读上也有重要作用。实验原理如下：由A，U，G，C四种核糖核苷酸中的三种人工合成某一种三核苷酸，取20种氨酰基-tRNA中的一种用14C或3H标记，使该三核苷酸与19种非标记及1种标记的氨酰基-tRNA以及适当的核糖体组成一个反应系统。三核苷酸代表mRNA上的一个三联体密码，使相应的氨酰基—tRNA结合到核糖体上。反应结束后