猪血清白蛋白的分.pptxVIP

猪血清白蛋白的分第1页/共29页第2页/共29页实验目的掌握血液样品的正确处理和制备方法掌握血清白蛋白粗分离的一般方法掌握离子交换法分离纯化蛋白质掌握蛋白质纯度检测的方法掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法学会考马斯亮蓝法测定蛋白质含量第3页/共29页原理与操作留样：2，3血清的制备 白蛋白的分离 留样：1留样：4,…白蛋白的纯化 白蛋白纯度的检测 蛋白质含量的测定白蛋白的相对分子质量的测定第4页/共29页一、血清白蛋白的分离1 采血 2 血清分离 3 盐析法分离血清白蛋白4 除盐第5页/共29页收集血清： 取2 mL血液，4 ℃，3,000 rpm　离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 mL至10 mL离心管；留0.1mL（样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳.第6页/共29页盐析：中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。分级盐析实现蛋白质的分离纯化。在血清中加入硫酸铵，当饱和度为50%时，血清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，饱和度达55%，白蛋白析出。 第7页/共29页量筒量取9 ml底液（50 %的饱和硫酸铵溶液），用移液管逐滴加入，不断摇晃。4 ℃静置2 h；4 ℃，13,000 rpm离心20 min，收集上清，留0.5 ml（样2）至1.5 ml离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；第8页/共29页用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5，用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH4.5）的体积（0.11×V）；逐滴加入饱和硫酸铵（pH4.5），振荡，4 ℃静置2 h；4 ℃，１3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 mL pH7.4的柠檬酸缓冲液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4＋存在；留0.1 ml（样3）至1.5 ml离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；NH4＋的检测：奈氏试剂第9页/共29页奈氏反应 奈氏试剂是络盐K2[HgI4]加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐砖红色的溶液或沉淀 第10页/共29页二、血清白蛋白的纯化离子交换柱层析：离子交换柱的安装平衡加样洗脱样品收集第11页/共29页在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间的静电吸引。蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度或pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。本实验采用的DEAE－纤维素离子交换剂.第12页/共29页层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱的盐浓度和（或）pH的方式洗脱，后一种方式又可以分为两种：一种是跳跃式的分段改变（梯度洗脱），另一种是渐进式的连续改变（连续洗脱）。第13页/共29页除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素层析柱上，在此pH 时，DEAE -纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β球蛋白（血清白蛋白等电点为4 . 9 ，绝大多数。α及β球蛋白等电点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。第14页/共29页DEAE-纤维素离子交换层析：装柱：将层析柱垂直固定。将DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜；洗脱液流速调节为 1mL/min；上样：将透析袋剪开，用移液管转至层析柱内，待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进入胶内；洗脱：采用连续梯度洗脱，用0.02～1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行洗脱，收集；记录出现峰值的管号(样品4,…)洗脱速度慢，可直接换B液（ 1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲液）第15页/共29页五、血清白蛋白的相对分子质量测定 --SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。第16页/共29页SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态；2.复合物都是椭圆棒状。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。第17页/共29页测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMW为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMW，再换算成蛋白质分子量．测定各条