蛋白的分离和纯化栗晓霞.pptxVIP

蛋白的分离和纯化栗晓霞第1页/共17页第2页/共17页蛋白质的分离和纯化 Isolation and Purification of Proteins第3页/共17页蛋白质的意义蛋白质是各种生物有机体的重要组成部分。是生命的物质基础之一。机体的很多活性物质如酶、多肽激素、抗体、核蛋白都是蛋白质，它们参与重要的生命活动。蛋白质也就成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要步骤就是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度的有生物活性的目的蛋白。因此高效的分离纯化技术是蛋白质研究的重要基础和关键之一。第4页/共17页 蛋白质的提取1.材料的选择原则含较高质量的所需蛋白来源方便2.组织细胞的破碎 高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。 反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。第5页/共17页蛋白质的提取3.提取根据其性质选用适当的溶媒和提取次数以提高收率防止细胞内外蛋白酶对有效成分的水解 应对方法：加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以一直或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以一直那些活性中心需要有巯基的蛋白水解酶的活性；加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清楚蛋白水解酶的活性其他因素对蛋白质构象的破坏作用 例如温度、PH、离子强度等第6页/共17页蛋白的分离纯化方法一 根据溶解度不同 二 根据分子大小不同 三 根据电离性质不同四 根据配基特异性不同第7页/共17页一 根据溶解度不同的分离纯化方法1.等电点沉淀蛋白质在等电点时溶解度最小。2.盐析沉淀——常用的蛋白质沉淀方法一定浓度的盐溶液（例如硫酸铵、氯化钠）可中和蛋白质的电荷以及水化膜受到破坏，影响了蛋白质的稳定性使蛋白沉淀3低温有机溶剂沉淀法——常用的蛋白质沉淀方法有机溶剂的介电常数比水低。在一定量的有机溶剂中，蛋白质分子间静电引力增加，水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀有机溶剂多为丙酮、乙醇注意：对于蛋白质的沉淀一般要求低温条件下进行第8页/共17页二 根据分子大小不同 的分离纯化方法1.透析和超滤透析是利用蛋白质分子对半透膜的不可透过性而将不同蛋白质分开此法简单，常用于蛋白质的脱盐，但耗时长超滤是利用超滤膜在外力作用下，大分子物质被截留而小分子滤过排出。该方法是根据分子大小和形状，在10-8 cm数量级进行选择性分离。常用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐、分级纯化第9页/共17页二 根据分子大小不同 的分离纯化方法2.分子排阻层析（分子筛层析、凝胶过滤）其原理是利用不同分子量的蛋白通过具有分子筛性质的凝胶而被分离。分离次序：在层析洗脱时，大分子受阻小而最先流出，小分子受阻大而最后流出。常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。第10页/共17页二 根据分子大小不同 的分离纯化方法3.密度梯度离心蛋白质的沉降速度取决于分子大小和密度。当其在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的沉降得快。而且当蛋白沉降到与自身密度相等的介质梯度时，就停止不前，可分步收集进行分析。该法在离心中使用密度梯度具有稳定作用，可以抵抗由于温度变化或机械振动引起区带界面的破坏而影响分离效果第11页/共17页三 根据电离性质不同的分离纯化方法1.电泳法带电介质在电场中向电荷相反的方向移动。这种性质叫电泳。蛋白质是两性电解质，在不同PH条件下，所带的电荷质和量各异。蛋白质移动的方向和速度主要取决于蛋白质所带的电荷性质、数量、质点的大小及形状。第12页/共17页三 根据电离性质不同的分离纯化方法1.电泳法常用方法支持物特点实例运用醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳效果比纸电泳好，时间短，电泳图谱清晰血浆蛋白电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶有电泳和凝胶过滤双重特点，因此电泳分辨率高。样品需要量少用于蛋白质分子量测定等点聚焦电泳两性电解质分辨率高用于蛋白质的分离纯化和分析免疫电泳琼脂或琼脂糖凝胶样品用量少。特异性高。分辨力强。用于蛋白质（例如抗体）的鉴定及纯度的检查第13页/共17页三 根据电离性质不同的分离纯化方法2.离子