蛋白质的分离、纯化和表征.pptxVIP

第1页/共50页蛋白质的分离、纯化和表征第2页/共50页Protein第3章 蛋白质的分离纯化和表征第3页/共50页一、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒子在电场中移动的现象。第4页/共50页一、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大pI通常在 6.0 左右第5页/共50页二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidal system）胶体溶液的特点：分子直径在1-100 nm内溶于水不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液第6页/共50页蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质第7页/共50页（二）蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 Ⅱ 不可逆沉淀强烈沉淀条件破坏Pr胶体溶液稳定性也破坏Pr结构和性质沉淀不能再重新溶解——变性沉淀如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等第9页/共50页1.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性第10页/共50页盐溶—盐析盐溶分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶原因？第11页/共50页盐析（（NH4）2SO4）蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？第12页/共50页2.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用3.等电点沉淀第13页/共50页4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态第14页/共50页三、蛋白质分离纯化的一般原则一.?分离纯化蛋白质的意义 1.研究蛋白质的结构与功能： 要求纯度高，不变性；2.提取活性的酶或蛋白质： 必须保持天然活性状态；3.作为药物或食品添加剂： 纯度要求一般。二、蛋白质提纯的总目标： 增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。第15页/共50页三、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶第16页/共50页四、蛋白质的分离纯化方法透析或超滤沉降平衡离心法沉降速度离心法离心沉淀1、根据分子大小分凝胶过滤层析等电点沉淀盐析（常用硫酸铵）有机溶剂沉淀2、根据溶解度分电泳离子交换层析3、根据电离性质分4、特异亲和力： 亲和层析第17页/共50页五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料第19页/共50页加压小分子溶出血液透析血液透析液小分子被带出透析机第20页/共50页凝胶过滤第21页/共50页凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大. 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex第22页/共50页（二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析第23页/共50页2.?盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。第24页/共50页3.有机溶剂分级分离法降低介电