蛋白质化学3的学习教案.pptxVIP

蛋白质化学3的学习教案;前言;　　液相色谱技术是根据混合物中溶质在互不相溶的两相间分配行为的差别而引起的移动速度的不同而进行分离的方法。 　　液相色谱分离技术具有分辨率高、设备简单、操作条件温、有利于保持生物大分子的活性等优点。 　　液相色谱因固相介质不同可分为凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、反向色谱、扩张床等。; 凝胶色谱是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。; 如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换色谱方法进行样品的分离。 离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 带有SO3－ 或COO－基团，通常以SO3－Na＋ 或COO－H＋形式出现的叫做阳离子交换基； 带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴离子交换基。;阳离子交换色谱过程;要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。 当pI pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI pH时，蛋白质带净正电荷。;1.7.５ 疏水作用色谱; 依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和色谱柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和色谱就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。;亲和色谱过程;要点归纳; ２. 凝胶过滤色谱是按照蛋白质分子大小进行分离的。根据使用的凝胶排阻分子量不同可以分离分子量范围不???的蛋白质。 在凝胶容许分离的分子量范围内，蛋白质分子量对数与洗脱体积成比例，所以可以根据标准蛋白质曲线求出未知蛋白质的分子量。;３. 离子交换色谱分离蛋白质主要取决于各种蛋白质所带净电荷，分为阳离子和阴离子交换色谱。在进行离子交换色谱时，时刻要想到这样的原则：处于等电点（pI）的蛋白质所带净电荷为零；当蛋白质所处溶液pH pI时，该蛋白质带负电荷，如果pH pI时，蛋白质带正电荷。 　一般是低离子浓度下吸附，高离子浓度下洗脱。 ;４. 疏水作用色谱是根据蛋白质与疏水性分离介质之间的疏水性相互作用的差别来实现生物大分子分离纯化的色谱技术。 一般是高离子浓度下吸附，低离子浓度下洗脱。;５.亲和层析取决于分离蛋白与配体的亲和程度。配体都是通过共价键与载体（树脂或葡聚糖凝胶）结合，配体可以是酶底物、抑制剂、抗体（或抗原）或其他特异识别要纯化的目的蛋白等的分子（或基团）。 ;感谢观看！