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血红蛋白提取;思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？;第3页/共50页;思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？;一、基础知识：;3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。;第7页/共50页;第8页/共50页; 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。; 3、缓冲溶液的配制;㈢电泳：;;第13页/共50页;聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶;二 实验操作;第16页/共50页;①目的：去除（ ） ②方法：（ ）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（ ），将下层（ ）的红细胞液体倒入（ ）;再加入用（ ）的（ ）质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间）;(2)血红蛋白的释放;;用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。; 取( )ml的血红蛋白溶液装入（ ）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（ ）中，pH为（ ），透析12小时，目的是（ ）或用于更换样品中的（ ）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。;第23页/共50页;2.凝胶色谱制作;底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。;⑤安装其他附属结构。;2）凝胶色谱柱填料的处理;①固定：将色谱柱处置固定在支架上;③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（ ）12小时。 ;3）样品加入与洗脱;②加透析样品;①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）的样品加到色谱柱的（ ） ③样品渗入凝胶床：（ ） ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 ⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集;血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 ;血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。;3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳;3.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度;⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。;由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。;① SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备;③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7 m