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淋巴细胞的分离及功能检测第1页/共15页第2页/共15页一、淋巴细胞的分离借助其表面标志及功能差异分为不同的群及亚群尼龙棉分离法E-花环分离法洗淘法流式细胞术（FCM）免疫磁球分离技术第3页/共15页二、 淋巴细胞的表面标志 CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞 CD3成熟T细胞 CD4 Th细胞、Mφ、HIV受体 CD8 Tc细胞、NK细胞的亚型 CD25 IL-2受体、活化T细胞 CD16、CD56 NK细胞第4页/共15页三、T细胞表面标志的检测方法1. 免疫荧光技术 直接法：细胞+标记的McAb 间接法：细胞+McAb+荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清 流式细胞术（FCM）：2. 免疫细胞化学法 APAAP酶免疫桥联法3. 微量细胞毒实验 细胞+McAb+补体第5页/共15页APAAP酶免疫桥联法第6页/共15页E-花环(erythrocyte rosette)实验外周血单个核细胞的分离E-花环实验第7页/共15页外周血单个核细胞的分离原理 常用的方法是Ficoll-Hypaque （又称淋巴细胞分层液）密度梯度离心法。 Ficoll-Hypaque 比重：1.077±0.001 RBC和中性粒的比重：约1.09 PBMC的比重：约1.075第8页/共15页Isolation of peripheral blood lymphocytes by Ficoll-Hypaque gradient第9页/共15页实验试剂和材料淋巴细胞分层液SRBC悬液肝素溶液Hanks或RPMI-1640培养液试管毛细细管玻片显微镜第10页/共15页E-花环实验原理 人T细胞表面有绵羊红细胞受体，即E受体 ，又命名为CD2；绵羊红细胞（SRBC）表面有CD2的配体，即LFA-3，将淋巴细胞与SRBC按一定比例混合后，在一定条件下就形成一个T细胞结合多个SRBC的玫瑰花一样的花环，即E-花环，取样涂片染色、镜检计数可得花环形成率。 如置4℃至少2h或过夜，所检出的E-花环称为总花环（Et），亦即T细胞的百分率；如减少淋巴细胞与SRBC的比例，经短时间的温育即行取样涂片镜检，仍可见部分E-花环，称为活性花环（Ea）。第11页/共15页第12页/共15页显微镜下的E花环 第13页/共15页实验目的和意义目的 * 掌握PBMC的分离方法 * 掌握用E-花环实验计数或分离外周血T淋巴细胞。意义 * 用于评价机体细胞免疫功能。 * 用于分离外周血T淋巴细胞第14页/共15页分离PBMC ? 吸取PBMC加入至5ml hanks液，离心，1000rpm ,10 min ?去上清，加入0.1ml（约1滴）SRBC ? 置于37oC水浴10min ?低数离心，500rpm, 5min ?吸去部分上清（约0.1ml），加1滴戊二醛固定10min ? 再加入1滴美兰染色1min? 取1滴滴片，盖上盖玻片，高倍镜下计数花环形成率E-花环实验操作骤第15页/共15页感谢您的欣赏
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