蛋白质测序仪.pptxVIP

蛋白质测序仪;蛋白质的氨基酸序列确定 每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列。实际上蛋白质的氨基酸序列是由DNA决定的。;A. 蛋白质的氨基酸组成的定量确定 酸水解：破坏蛋白质的肽键 柱层析：进行氨基酸定量分析，每个氨基酸的量与洗脱峰 的面积成比例。;B. Edman降解方法常用于氨基酸序列的测定;第一轮降解; PTH－丙氨酸;2、?? DNS-Edman法 用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。 荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-C1)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-蛋白质再经酸水解可释放出DNS-氨基酸。 DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 3、?? 有色Edman法 荧光基-团或有色试剂标记的PITC试剂。 4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’异硫氰酸酯。 ;第8页/共18页;4、?? 用自动序列分析仪测序 仪器原理：Edman法。 1967液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。 1971固相测序仪 表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。 1981气相测序仪 用Polybrene反应器。 （聚阳离子）四级铵盐聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97% 气相：5pmol 60 肽 98%;二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 二硫键的确定（对角线电泳法） 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽，测序 与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。 ;酰胺的确定 Asp –Asn、Glu-Gln 酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn 举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val- 此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。 ;糖、脂、???酸基位置的确定 糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷 脂类：Ser、 Thr、Cys 磷酸：Ser、 Thr、His 经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4) Arg-Thr-Leu-Ser(PO4) Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4) ;C. 大蛋白被水解成肽段后再测序 Edman降解法测序一次只能连续降解几十个氨基酸残基。要测定大的蛋白质的氨基酸序列，需要将蛋白质降解为一些肽段，然后再进行Edman降解测序。 溴化氰（BrCN）：可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基反应 生成一个C末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新的N 末端残基的肽。 胰蛋白酶：特异地催化赖氨酸（Lys）残基和精氨酸（Arg） 残基羧基侧的肽键的水解， 胰凝乳蛋白酶：特异地催化苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸 （Tyr）和色氨酸（Trp）三种芳香族氨基酸残基羧基一 侧的肽键水解。;肽段拼接成肽链 16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS ;胰蛋白酶作用; 将蛋白质水解为氨基酸，测组成;第17页/共18页;感谢观看！