BIOSEP12蛋白质沉淀法.pptxVIP

BIOSEP12蛋白质沉淀法第1页/共26页 1 概述 优点A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；C、使中间产物保持在一个中性温和的环境；D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降解，提高产物稳定性；E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。缺点：A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；B、过滤较困难第2页/共26页 2 蛋白质溶解蛋白质溶解：相似者相溶aa的亲水性和疏水性：有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水aa所占的%等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水aa所占的%等。如纤维蛋白原。第3页/共26页 3 蛋白质溶液的稳定因素1)、水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro)2)、静电排斥 ? zeta电势 Nernst Potential—胶核表面电位(不可测) Stern Potential—(不可测) ? Potential—滑面电位(可测,mobility) ?电位 Nernst电位 ionic strength3)、|pH水 – pI| Value |pH水 – pI| Value? zeta电势? 水化层? 静电排斥?Tight hydration shellProtein coreLoose hydration shell第4页/共26页 第5页/共26页 4 蛋白质沉淀方法分类1）、盐析法2）、有机溶剂沉淀法3）、 |pH水 – pI| Value调节法4）、亲水聚合物沉淀法5）、聚电解质絮凝法6）、高价金属离子沉淀法7）、亲和沉淀法第6页/共26页 5 盐析法机理：A、?zeta potential；B、?hydration shell第7页/共26页 5 盐析法计算: Cohnx经验公式 式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)；I为离子强度；m为盐的摩尔浓度；β值为蛋白质在纯水中(I=0时)的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质pI时最小；Ks为盐析常数，与温度和pH值无关。第8页/共26页 5 盐析法方法: A、 “Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的。B、“β”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。C、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法。第9页/共26页 5 盐析法影响因素A、无机盐种类感胶离子序(Hofmeister序列): In 1888，Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 对阳离子排序为： Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+第10页/共26页 5 盐析法结论：a 不同种类的盐主要影响Ks；b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。无机盐的挑选原则： a 较高的盐析效能；b 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；c 溶解度受温度的影响小；d 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；e 不易引起蛋白质的变性；f 价格低廉；最常用(NH4)2SO4。优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。第11页/共26页 5 盐析法B、无机盐添加方式第12页/共26页 5 盐析法C、温度T 主要考虑不能影响主要产物的活力,即在其稳定的温度下盐析,可通过实验决定,一般来说,温度越低,形成沉淀越不易,但也有相反的情况.实际上,盐析的温度范围较大,所有一般都在常温下盐析.第13页/共26页 5 盐析法D、溶液pHpH影响Cohnx方程中的?值。见图图有何用？第14页/共26页 6 等电点沉淀法 等电点沉淀法中的pH值作用于β值而隐含在Cohnx公式中，pI值通常在pH4~6范围内变化，一般用无机酸（