第三节基因工程载体.pptVIP

生命科学学院 一、质粒表达载体 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子 位相载体 融合型表达载体 (一)原核表达载体 当前第95页\共有127页\编于星期五\21点 生命科学学院 一、质粒表达载体 (一)原核表达载体 分泌型表达载体 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 当前第96页\共有127页\编于星期五\21点 生命科学学院 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体 原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异， 真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。 酵母是真核表达的首选系统 酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中繁殖，又能在酵母中复制、表达和选择。 当前第97页\共有127页\编于星期五\21点 生命科学学院 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体 DNA复制起始区（含两类复制起始序列） 选择标记（营养缺陷型或显性选择标记） 有丝分裂稳定区 表达盒(启动子、分泌信号序列、终止子等) 当前第98页\共有127页\编于星期五\21点 生命科学学院 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体 当前第99页\共有127页\编于星期五\21点 生命科学学院 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体 当前第100页\共有127页\编于星期五\21点 三、噬菌体-质粒杂合载体 柯斯质粒载体的基本特点 具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)； 具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)； 具有较高容量（45 kb）的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。 不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬 菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 。 当前第63页\共有127页\编于星期五\21点 三、噬菌体-质粒杂合载体 柯斯质粒载体的构建 当前第64页\共有127页\编于星期五\21点 三、噬菌体-质粒杂合载体 应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序 当前第65页\共有127页\编于星期五\21点 三、噬菌体-质粒杂合载体 柯斯质粒载体的克隆原理及步骤 1．分离外源DNA片段35～45kb 2．外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同 3．体外包装：在?的A蛋白的功能作用下切割cos位点并将其中的DNA包装到成熟的?噬菌体颗粒中去 4．感染E.coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos位点的环化，而形成粘粒载体，象质粒一样复制 当前第66页\共有127页\编于星期五\21点 四、人工染色体及其应用 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时考斯质粒(45kb)和噬菌体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 或称为自主复制序列(ARS) 当前第67页\共有127页\编于星期五\21点 四、人工染色体及其应用 人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染 色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必 备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有 第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位 点的序列，以及合适的选择标记基因。 与其他的克隆载体相 比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至 3000kb的外源DNA片段。 当前第68页\共有127页\编于星期五\21点 四、人工染色体及其应用 (一)酵母人工染色体 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。 YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。可以接受350-400kb的外源DNA片段。 四膜虫的端粒序列 酵母染色体的复制