实验 高效液相色谱法.pptVIP

1.掌握高效液相色谱法测定饮料中糖精 钠、苯甲酸和山梨酸的原理和方法 2.熟悉高效液相色谱仪的使用方法 3.了解高效液相色谱仪的仪器结构 [目的与要求] 当前第1页\共有31页\编于星期四\17点 [方法原理] 在适宜的条件下,高效液相色谱可同时分离饮料中的糖精钠、苯甲酸、山梨酸。样品超声除去二氧化碳和乙醇,调pH至近中性,过滤后进高效液相色谱仪,经反相C18 液相色谱分离后,紫外检测器230nm波长处检测。 以色谱峰的保留时间定性,利用色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量 当前第2页\共有31页\编于星期四\17点 1.仪器: 高效液相色谱仪,配备二极管阵列检测器; 超声波清洗仪; 50ml容量瓶;50ml烧杯;50μl微量进样器 [仪器与试剂] 当前第3页\共有31页\编于星期四\17点 糖精钠标准储备溶液(10.0mg/ml): 准确称取于120℃烘干4h后的糖精钠(C6H4CONNaSO2·2H2O)0.5000g,加水溶解 后定容至50ml 苯甲酸标准储备溶液(5.0mg/ml): 准确称取0.2500g,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶解, 定容至50ml 山梨酸标准储备溶液(5.0mg/ml): 准确称取0.2500g山梨酸,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶 解,定容至50ml 标准混合使用液 (含糖精钠1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml):准确吸取各标准储备溶液5.0ml,加水定容至 50ml 2.试剂: 稀氨水(1+1);碳酸氢钠溶液:20g/L;甲醇(色谱纯) 当前第4页\共有31页\编于星期四\17点 2.配制标准系列: 取9只50ml容量瓶分别编上号码,按下表配制标准系列。 当前第5页\共有31页\编于星期四\17点 混合标样中各物质的浓度 当前第6页\共有31页\编于星期四\17点 当前第7页\共有31页\编于星期四\17点 1.样品处理:吸取10.00～20.00ml汽水,放入50ml烧 杯中, 超声除去二氧化碳,用稀氨水调pH7.0,加水定 容至50ml,用滤膜(0.45μm)过滤,备用。 [操作步骤] 当前第8页\共有31页\编于星期四\17点 1.插好电极,打开电源开关,按模式键切换到pH测量状态 2.用两点法进行校正(b=2)(pH 4.01,6.86,9.18) 3.按模式进入b=2 4.将电极浸入标准缓冲液中(pH=6.86),按“校正”,当到达 终点时显示屏上显示相应校正结果;将电极放入第二种 标准缓冲液(pH=4.01或9.18),按“校正”,当到达 终点时 显示屏上显示相应校正结果;按“读数”,保存校正结果 并退回到正常的测量状态 5.将电极插入到被测液中,调节pH到所需值 pH计的使用 当前第9页\共有31页\编于星期四\17点 (1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤 其是使用无机盐配制的缓冲液。 前处理 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：同样适用于水溶性样品和有机溶剂 当前第10页\共有31页\编于星期四\17点 3.测定 色谱条件: 色谱柱:C18 ,4.6mm×150mm; 流动相: 甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95); 流速:1ml/min 检测波长:230nm 取样品处理液和标准系列溶液各10μl注入高效液相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间为依据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计算回归方程),从标准曲线上查出(或根据回归方程求出)样液中被测物质的含量,按下式计算: 当前第11页\共有31页\编于星期四\17点 式中: Cx为样品中被测物的含量,g/kg C 为在标准曲线上查得的相对应的糖精钠、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/ml V0 为样品定容体积,ml V 为取样体积,ml 当前第12页\共有31页\编于星期四\17点 [思考题] 1.为什么被测溶液需要除去二氧化碳? 2.采用230nm为测定波长,对样品中山梨酸 的测定有何影响？ 当前第13页\共有31页\编于星期四\