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实验四 蔗糖酶活力测定 ——3.5－二硝基水杨酸法 一、实验目的和要求1、掌握酶活力测定的基本原理和方法；2、学习酶的比活力的计算。二、实验基本原理 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉（Nelson-Smogyi）试剂比色法，斐林试剂法等。 本实验采用3.5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在520nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。 蔗糖酶活力单位(u)： 蔗糖酶在50℃, pH4.5的条件下，每分钟水解产生1mg葡萄糖所需的酶量。蔗糖酶比活力的计算： 酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。  比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白mg数，即每mg蛋白所含有的酶活力单位数。 比活力＝活力单位/mg蛋白 三、实验材料与试剂1、实验材料 蔗糖酶样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ2、实验试剂① 3,5－二硝基水杨酸试剂； 甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液. 甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。 ② 1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量198.17）；③ 5％蔗糖溶液；④ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；四、实验器材与仪器1、恒温水浴（25℃、100℃）；2、可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿；3、试管、试管架；4、移液管；5、微量移液器：200μl、 1000μl； 五、实验操作方法和步骤(一) 蔗糖酶活力的测定1、标准曲线的制作 按下表加操作： 以还原糖（mg数）为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线。 /L葡萄糖标准溶液（ml） 0.00 0.200.30 0.40 0.50 0.600.70H2O （ml） 2.0 1.801.701.601.501.401.303.5－二硝基水杨酸 (ml) 1.01.01.01.01.01.01.0 将各管溶液混匀后，在100℃恒温水浴加热5分钟， 取出立即用冷水冷却至室温 H2O（ml）7777777 将各管溶液混匀A520 样 品空白I(1:150稀释)Ⅱ(1:150稀释)Ⅲ(1:100稀释)Ⅳ(1:10-30)编 2mol/L乙酸缓冲液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5H2O(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.55％蔗糖溶液 (ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保温时间立即混匀后，50℃ 保温10分钟，用冷水冷却至室温3.5－二硝基水杨酸试剂(ml)1111111111111在100℃恒温水浴中加热5分钟,用冷水冷却至室温蒸馏水7777777777777混匀A5202、蔗糖酶的酶活力测定按下表加样： 体 积(ml)蛋白浓度(mg/ml)总蛋白(mg)活 力(u/ml)总活力u比活力u/mg样品Ⅰ样品Ⅱ样品Ⅲ样品Ⅳ（二）实验结果 1、蔗糖酶活力和比活力的计算： 2、蔗糖酶各步纯化样品的纯度比较 六、结果分析讨论七、注意事项1、酶活力测定时，要控制好反应时间，各管的酶反应时间一定要一致，否则会影响整体结果。2、加各反应试剂的体积一定要准确，否则也会影响最终结果。