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生物技术课件第1页/共23页 ContentsPCR的基本原理 1PCR反应五要素2PCR的步骤3PCR反应特点 4PCR技术研究新进展 5PCR仪器的发展 6在兽医分子生物技术中的应用7第2页/共23页 1.1 PCR的基本原理 聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 第3页/共23页 1.2 PCR的基本原理变性退火 延伸PCR的基本步骤第4页/共23页 2、PCR反应五要素引物酶dNTP模板 缓冲液 即PCR反应的五要素第5页/共23页 3. PCR的步骤 1DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA2退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 第6页/共23页 4、PCR反应特点PCR反应特点特异性强 对标本的纯度要求低 灵敏度高 简便、快速 第7页/共23页 4.1 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：　　①引物与模板DNA特异正确的结合；　　②碱基配对原则；　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；　　④靶基因的特异性与保守性。第8页/共23页 4.1 特异性强其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 第9页/共23页 4.2 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。第10页/共23页 4.3 简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 第11页/共23页 4.4 对标本的纯度要求低　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。第12页/共23页 5、PCR技术研究新进展简并PCR的原理基本原理就是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库，从不同生物物种中扩增出未知核昔酸序列的基因。简并PCR简并PCR的应用找到进行PCR的基因序列，就会发现新基因。基因表达的检测、病毒的检测、基因组研究等。第13页/共23页 6、PCR仪器的发展pcr温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。自perkin –elmer cetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。第14页/共23页 国内外生产的几种DNA扩增仪 仪器型号生产厂家型式特点管数报价1109型北京新技术所与军科院联合机械臂 　　变温水浴电子调温40×0.5ml16400元/台90A/B型中科院遗传所机械臂 　　变温水浴电热14000元/台PTC-51A/B型军事医学科学院变温气流电子调兼作套式30×0.5ml12000元/台DNA Thermal CyclerPerkin –ElmerCetus(美)变温铝块压缩机致冷48×0.5mlUS $ 20000.-Thermocycler 　　＃60　　＃00　　＃180B..Braun 　　Biotech　　(德)变温水浴98℃四档电热,自来水冷却　　100×1.5ml　　DM 30000.-第15页/共23页 7、原位PCR在兽医生物技术中的应用1. 检测病原体2、观察病原体在体内的分布规律3、检测导入基因原位PCR在兽医生物技术中的应用第16页/共23页 7.1 检测病原体与原位杂交相比,原位pcr先对待检测片断进行扩增,因而具有高度的敏感性,可检出原位杂交检不出的单拷贝、低拷