微孔板检测技术的原理和应用.pptxVIP

第1页/共121页微孔板检测技术的原理和应用第2页/共121页原理及应用介绍大纲光的物理简介光吸收检测的原理与应用实例荧光检测的原理与应用实例发光检测的原理与应用实例第3页/共121页光的物理简介光的本质光的性质第4页/共121页光的本质红外线一种能量电磁波电子能级（轨道） 波粒二相性衍射光电效应第5页/共121页光的性质c = λ × ν基本性质速度：3×108m/s波长：颜色频率：能量E = hν其他性质偏振荧光：激发第6页/共121页光的性质物体的颜色白光是复合光单色光互补色光溶液的颜色由溶液中的质点（分子，离子）吸收特定波长的光，透射其互补色的光吸收曲线KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4: abcd)第7页/共121页原理及应用介绍大纲光的物理简介光吸收检测的原理与应用实例荧光检测的原理与应用实例发光检测的原理与应用实例第8页/共121页I==e0Absorbance lgcb××I0II光吸收检测的原理 （公式反应了与浓度的依赖关系） I0 入射光强度 I 透射光强度 ? 摩尔消光系数 b 光程 c 样品浓度当光穿过待测物时，光的强度（能量）发生变化第9页/共121页Absorbance(Optical Density):% of LightTransmitted:% of LightAbsorbed:0OD100 % 0 %1OD 10 % 90 %2OD 1 % 99 %3OD 0.1 % 99.9 %4OD 0.01 % 99.99 %5OD 0.001 % 99.999 %6OD 0.0001 % 99.9999 %7OD 0.00001 % 99.99999 %8OD 0.000001 % 99.999999 %吸光值(Absorbance)的意义第10页/共121页影响结果的因素单色光不纯非平行入射光介质不均匀溶液浓度过高溶液中发生化学反应第11页/共121页光吸收的应用如果光的强度变化能够反映被测量物的待测性质，则显色反应都可以使用光吸收核酸和蛋白质的紫外光吸收检测酶联免疫检测（ELISA）酶动力学分析细菌内毒素检测乙酰胆碱脂酶检测细胞活性检测（MTT）环境监测第12页/共121页核酸的紫外光吸收检测DNA，RNA的吸收峰在260nm标准曲线法光程测量法（光程未知【酶标板】）校正吸收值到1cm光程通过水（如果溶剂是水）的1cm光程吸收值来校正第13页/共121页标准曲线法作光吸收最常用的方法已知浓度样品吸收值（同一光程【比色杯】）标准曲线未知吸收值带入，得到未知样品浓度第14页/共121页光程测量法光程不一致时（酶标板）通过水的吸收值（1cm光程）来求得实际光程水在977nm有吸收峰，在900nm几乎无吸收（与溶质的吸收峰无重叠）Pathlength：实际的光程A977：水溶液样品在977nm的吸光值A900：水溶液样品本底Awatercm-1：1cm光程比色杯中水的吸光度值（ A977 ）－本底值（ A900 ）第15页/共121页光程测量法Asample：样品在特定波长的吸光值 ?水相样品的吸收值/cm光程：光程的校正水：998nm等消光点（受温度影响小） 977nm吸收峰第16页/共121页实例：DNA浓度的测量水的吸光度/cm Result: Awater: A998 – A900: 0.159 OD/cm样品的吸光度A998 – A900: 0.132 OD A260: 0.084 OD第17页/共121页实例：DNA浓度的测量光程的校正DNA的分光光度计标准，1 OD/cm 相当于50ng/ul DNA相当于40ng/ul RNA相当于33ng/ul Oligo结果计算：0.101×50ng/ul=5.05ng/ul第18页/共121页实例：蛋白定量Coomassie Brilliant Blue G-250 CBG 是一种指示剂470 nm595 nm加入蛋白质酸性环境下呈茶色与蛋白质结合变蓝色第19页/共121页实例：ELISA抗原，抗体，底物，显色反应阴性域值，阳性程度，定量第20页/共121页实例：细胞活性检测（MTT）细胞代谢活动与活细胞数直接成比例（线粒体的活性?脱氢酶的活性）MTT：一种甲氮唑盐，是细胞线粒体脱氢酶的底物；活 细胞内的线粒体脱氢酶可将MTT分解产生蓝黑色（fromazan）产物进入活细胞，被分解，裂解细胞，分析吸光度Fromazan吸光谱