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精减分子生物学技术简介硕第1页/共43页第2页/共43页第九章 分子生物学技术简介第3页/共43页Contents核酸纯化技术与电泳技术PCR技术分子杂交与印迹技术基因靶向技术第4页/共43页一、核酸纯化技术DNA纯化 1. 核酸混合物成分: 结构类-细胞碎片，细胞器，其他大分子-DNA，RNA，Protein，糖类，脂类等小分子-氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无机物等 2. 关键: DNA，RNA—Protein 3. 方案： Protein变性苯酚：强变性25氯仿：弱变性24异戊醇：消泡1酚氯仿抽提法第5页/共43页一、核酸纯化技术DNA纯化4. 苯酚的处理：重蒸-饱和-pH 重蒸：去除醌类氧化物 饱和：防止核酸损耗 pH： pH7.0-8.0-核酸最适合 方法：蒸馏（183℃）-收集（棕色瓶）-饱和与调pH（Tris-HCl pH8.0）-0.1% 8-羟基喹啉- 4 ℃或-20 ℃保存第6页/共43页方法样品+等体积饱和苯酚10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡离心（12000*g）取上清第7页/共43页核酸相Protein变性相有机相第8页/共43页电泳影响因素1. DNA物理性质 质粒： CC＞L ＞OC 线形：长度与泳动速度成负相关2. 介质性质 分离范围：agrose：100bp-60kb PAGE：5-500bp3. 电压：5v/cm4. 缓冲液：TAE，TBE，TPE三羟甲基氨基甲烷Tris碱第9页/共43页点样孔● 不同二级结构形态及其电泳速度Linear DNA. LOpen Circle DNA OC relexed formSupercoiled circleCovalent Closed Circle CCC第10页/共43页核酸定量的原理核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm的紫外波段有一强烈吸收峰，最大吸收值在260nm附近。纯核酸能用此法定量测定含量，但不纯样品不能用此法作定量检测。琼脂糖凝胶电泳分离出区带，用EB染色后在紫外灯下粗略估计含量。第11页/共43页核酸定量的原理双螺旋DNA：1OD260=50ug/ml单链DNA/RNA：1OD260=40ug/mloligonucleotide ：1OD260= 20 ?g/ml纯度：OD260/OD280=1.8-2.0小于1.8，表明有蛋白质污染大于2.0，表明有RNA污染。第12页/共43页配10μM的引物贮液加多少μL ddH2ODouble-distilled第13页/共43页Contents核酸纯化技术与电泳技术PCR技术分子杂交与印迹技术基因靶向技术第14页/共43页二、PCR技术 PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。 第15页/共43页PCR技术与Nobel Prize Kary B. MullisMichael Smith第16页/共43页Polymerase Chain Reactiona copying machine for DNA molecules DNA molecules can be mass-produced from incredibly small amounts of material with PCR. Mullis discovery allows the chemist to mimic the cells own natural DNA replication process in a test tube. It has now become much easier to characterise and compare the genetic material from different individuals and organisms.第17页/共43页By cycling through the three temperatures the strands are separated and built up again. Extracted DNAAbout 95℃,the ds are separated About 55℃,the primers bind to the strands at the correct positionsAbout 72℃,the DNA polymerase which is added builds up two new comple