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时间分辨荧光免疫分析技术详解演示文稿 当前第1页\共有21页\编于星期四\18点 优选时间分辨荧光免疫分析技术 当前第2页\共有21页\编于星期四\18点 ①免疫荧光 ②放射免疫 ④化学发光 ⑥电化学发光 ⑤时间分辨荧光 ③酶联免疫 当前第3页\共有21页\编于星期四\18点 标记免疫技术的理论检测灵敏度 放射免疫 10-10-10-12 mol 酶联免疫 10-9-10-10 mol 化学发光 10-15 mol 时间分辨荧光 10-18 mol 电化学发光 10-18 mol 当前第4页\共有21页\编于星期四\18点 一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）（Time-resolved fluorescence immunoassay） 背景介绍 基本原理 技术特点 反应模式 当前第5页\共有21页\编于星期四\18点 背景介绍 1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini 和 Hemmila首次提出了建立 稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论 1983年，Soini 和 Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨 荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年， Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素 (hCG)进行了时间 分辨荧光免疫分析 1984年， Hemmila确定了DELFIA(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成 为Wallac的专利技术 1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA 的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen 2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖 当前第6页\共有21页\编于星期四\18点 基本原理 三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy) 等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长 的特点 DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu) 为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的- NH2 连接。在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具 有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA- Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的 配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地 放大 FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物， 通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于 BCPDA 的可检测性不够理想，FIAgen 需要利用生物素- 亲合素信号放大来弥补BCPDA 检测灵敏度的不足 当前第7页\共有21页\编于星期四\18点 DELFIA标记技术 碱性 当前第8页\共有21页\编于星期四\18点 时间:(μs） 0 400 800 1000 340nm激发光 第二个循环 荧光 短寿命荧光 613nm长寿命荧光 延迟时间 测值时间 通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光 分辨开来，使理论本底达到0 当前第9页\共有21页\编于星期四\18点 300 400 500 600 荧光强度 激发光 发射光 波长(nm) 当前第10页\共有21页\编于星期四\18点 Tb Dy Eu Sm 500 发射光强度 200 400 0 延迟时间(μs) 600 发射光波长(nm) 500 发射光强度 0 延迟时间(μs) 当前第11页\共有21页\编于星期四\18点 TRFIA技术特点 极长的荧光衰退时间 铕：730000ns Stokes位移大 铕：激发光340nm，发射光613nm 狭窄的发射峰 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 当前第12页\共有21页\编于星期四\18点 固相包被抗体 铕标记抗体 孵育 Eu 待测抗原 + + Eu Eu + 增强液 + Eu 双抗体夹心法示意图 当前第13页\共有21页\编于星期四\18点 双抗原夹心法示意图 Eu + + 孵育 + Eu 孵育 增强液 + Eu 固相包被抗原 待测抗体 铕标记抗原 当前第14页\共有21页\编于星期四\18点 中和法示意图(回滴定法) + + 孵育 + Eu 孵育 Eu Eu 增强液 + + Eu 待测抗体 铕标记抗体 中和抗原 当前第15页\共有21页\编于星期四\18点