DB37_T 4052-2020小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 長东省地方标准DB37/T4052—2020小反兽疫恒温扩增检测技术规范Technical specification for isothermal amplification of Peste des petits ruminants2020-07-09发布2020-0809实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 4052—2020附录C（资料性附录）小反当兽疫恒温扩增检测结果判读阴性对照和阳性对照见图C.1。Amplification Plot600,09650.99NegutihPoaive20.0020.019.00)180.00158.00Cycle图]C. 1阴性对照和阳性对照样品检测见图C.2。Amplification20000-0000:04.0000:6:0000.08:0000.12:0600.120000:1490Time (nhimm:ss)图]C. 2样品检测 DB37/T 4052—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东师范大学、山东省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心、杭州众测生物科技有限公司、桂林市临桂区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：陈蕾、孙文博、吴晓东、陈艳如、愿炳次、蒋文明、李华、刘腾腾、杨慧婷、单世娟、陈秋红、孙晓洁、杨桂文。I DB37/T 4052——2020小反兽疫恒温扩增检测技术规范1范围本标准规定了小反当兽疫（PPR）的恒温核酸扩增检测技术的要求。本标准适用于小反当兽疫的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489一2008实验室生物安全通用要求NY/T 541—2016善医诊断样品采集、保存与运输技术规范3原理核酸恒温扩增技术是依赖解旋醇解开双链DNA，再依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下扩增。4试剂或材料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1水：符合GB/T6682中规定的一级水。4.21XPBS溶液（pH值7.4）配制见附录A.1.4.3核酸提取试剂：a):[0Z]3]氯仿：c)75%乙醇：异丙醇。4.4恒温扩增试剂盒。4.5不含RNA醇的水：DEPC处理过的不含RNA酶的水、4.6恒温扩增检测引物：恒温扩增检测引物表B.1.4.7无水乙醇。4.8微量移液器配套的带滤芯吸头。4.9离心管：1.5 mL。5材料及设备 DB37/T 4052—2020主要仪器设备：a)微量移液器：10、20μ、100μ、1000:b) 高速台式离心机：离心力≥8000g：c)生物安全柜：d)冰箱：e)涡旋振荡器：f)研磨管：g)荧光定量PCR仪：h)天平：感量为0.001g。6样品6.1基本要求应符合GB19489—2008和NY/T541—2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集，保存与运输的要求。6.2样品采集6.2.1棉拭子样品无菌采集羊口鼻棉拭子。6.2.2组织样品无菌采集病死羊的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。2℃~8C低温运至实验室用于检测。6.2.3环境样品采集与病羊相关场所的龚便、饲料、污水样品。2℃8C低温运至实验室6.3样品处理方法6.3.1口鼻拭子样品处理口鼻拭子管6000g囊荡45秒，取200μL进行核酸提取，6.3.2淋巴结、牌、胸腺等组织样品处理取0.05g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000g震研磨45秒，制成约10%的组织匀浆液，5000g离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。6.3.3粪使、饲料样品处理取1g的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000g/min震荡研磨45秒，制成约10%的匀浆液，5000g/min离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。6.3.4污水样品处理取200μL污水进行核酸提取。2 DB37/T 4052—20207操作步骤7. 1RNA的提取-Trizol法7. 1. 1取6.2处理后的样品向处理好的300μL组织样品或血清中加入800μLTrizo1，！重复吹打以裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上效置10min～25min。7. 1. 2加入氯仿200μL，用力振荡30s，室温放置5min。7. 1. 34 ℃C, 8 000 g 离