DB37T 420.1-2004海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程 第1部分:组织学诊断法.pdf

ICS 65.150B 51DB37山东省地電方标准DB37/T 420.1-2004海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程第一部分：组织学诊断法2004-12-14发布2005-01-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T420.1-2004前 言本标准由山东省海洋与渔业厅提出本标准由山东省渔业标准化专业技术委员会归口，本标准起草单位：山东省海水养殖研究所。本标准起草人：李天保、叶海斌、刘恩孚、朱安成、吴志宏。 DB37/T420.1-2004海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程第一部分：组织学诊断法1范围本标准规定了指状拟舟虫病组织学诊断所需试剂与材科、检验步骤和结果判定，本部分诊断结果可疑时，补充扫描电镜诊断进行结果确认。本标准适用于海水养殖鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、真鲷等养殖鱼类品种，感染指状拟舟虫情况的筛选和诊断。2指状拟舟虫病的病理学特征指状拟舟虫是海水鱼类养殖过程中引发寄生虫疾病的主要寄生虫之一。感染指状拟舟虫可导致鱼类肌肉组织及脑组织严重病变、坏死，并大量寄生于循环系统中春噬血细胞，导致贫血，感染初期，在鱼的体表以及口腔粘膜等处发生溃烂，严重时侵入鱼体内，常继发感染致病性细菌导致鱼类死亡率增高。3试剂和材料若非注明，本标准使用确认为分析纯试剂。石蜡（熔点52℃～54℃）：切片级。二甲苯.盐酸。石炭酸.无水乙醇。95%乙醇。90%乙醇。80%乙醇。75%乙醇。70%乙醇。苏木素：生物染色素，伊红Y（水溶性）：生物染色素。中性树胶。过滤海水：盐度为2030的海水在室内放置一周后，经滤纸和0.22μ滤膜过滤。Bouin s液按附录A的规定.苏木精-伊红染色液按附录A的规定，4检验步骤5.1取体表溃烂的病鱼，取体表溃烂组织块，组织块大小约0.3cm～0.5cm，Bouins液固定24h，蒸馈水冲洗后移入70%乙醇中保存。5.2组织块经各级乙醇脱水、石蜡包埋，切片厚度为5μ～7μm5.3切片制备过程见附录B，苏本精-伊红染色后封片，并检查。1 DB37/T 420.1-20045结果判定在表皮溃烂组织样品中有指状拟舟虫为阳性。表皮溃烂组织样品中没有发现指状拟舟虫为阴性，N DB37/T420.1-2004附录A（规范性附录）试剂配方A.1苏木精液苏木精2g，无水乙醇250ml，硫酸铝17.6g，蒸镐水750ml。碘酸钠0.2g，冰酷酸25ml。先将苏木精溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后如入冰醋酸。A. 2水溶性伊红染液伊红Y0.25g0.5g，蒸编水100ml先取少量蒸馏水加入伊红，用玻璃棒将伊红研碎，再加入全部蒸馏水。A. 3Bouins液饱和苦味酸水溶液75ml，甲醛水溶液25ml，冰酷酸5ml。A. 4盐酸乙醇分化液盐酸0.5ml，75%乙醇100ml。 DB37/T 420.1-2004附录B（资料性附录）组织切片方法B. 1组织脱水使用乙醇为脱水剂，脱水顺序和时间如下表：乙醇浓度75%85%90%95%95%无水乙醇无水乙醇无水乙醇脱水时间5h~10h5h~10h5h~~10h5h~10h5h~10h30min30min1h~~2h脱水必须在有盖子的瓶子中进行，以防乙醇吸收空气中水分。B. 2组织透明用二甲苯进行组织透明，将脱水完毕的组织块置于滤纸上用冷风稍吹干后，放入二甲苯中进行透明处理。处理过程分三个步骤，第一和第二步各处理30min，第三步处理1h。B.3漫蜡将经二甲苯透明后的组织块用冷风稍干并立即投入到液体石蜡中去，石蜡温度52℃～54℃，浸蜡三次，时间分别为1h～2h、1h~2h和2h~~4h。B.41包埋在52℃～54℃融蜡炉中将石蜡熔融后，倒入预先放入组织块的包埋盒中，应注意组织的切面朝下并放平整，石蜡凝固，将包埋盒打开，用刀片把组织蜡块切开，待完全冷却变硬后，再修整蜡块。B.5切片把组织蜡块装在切片机上，左手平持毛笔，右手旋动切片机把，切片带出来后，用毛笔轻轻托起再用眼科锻子轻锻蜡片，以正面放入展片箱中，其温度可根据石蜡熔点选用，待摊平后捞片。切片附片时，左手持清洗好的载玻片的一端，插入水中附贴组织片，右手用锻子或毛笔辅助推动，待组织片附贴于载玻片上后，再移至载玻片中央．附片后，在空气中稍凉干即可进行烤片。B.6脱蜡二甲苯处理两次，每次2min~5min：无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇各处理1min：自来水和蒸馈水各洗2min。B.7染色苏木精液染色5min，自来水洗1min，75%盐酸乙醇分化30s，自来水洗，温水（50C）5min，蒸馏水Imin，95%乙醇1min，伊红Y 1min~2min。B.8脱水、透明和封片95%乙醇1min，95%乙醇重复一次，无水乙醇1min，重复无水乙醇1min，二甲苯-石炭酸液（3:1）1