第四章目的基因的制备演示文稿.pptVIP

b) 接头-衔接头法 当前第63页\共有92页\编于星期三\11点 c) mRNA-cDNA克隆法 方法：在mRNA反转录合成cDNA第一链后，将dA残基加到mRNA：cDNA杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以DNA. 缺点：克隆的效率低（为双链cDNA克隆的1/10） 当前第64页\共有92页\编于星期三\11点 6) cDNA文库的筛选和鉴定 核酸杂交: 是最常用、最可靠的方法之一.可 　 大规模地分析文库的克隆子 * 同源探针：至少含有所需cDNA克隆的一部 分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA 文库中的全长克隆. * 部分同源探针：探针的序列与所要筛选的 cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆 家族基因. 当前第65页\共有92页\编于星期三\11点 文库在液体培养基中扩增保存 方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入 含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。 缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。 当前第31页\共有92页\编于星期三\11点 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大 当前第32页\共有92页\编于星期三\11点 b）基因文库的筛选 表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选． 抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长． 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选． 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选． PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段． 当前第33页\共有92页\编于星期三\11点 3. 真核生物基因组文库的构建 1) 真核生物基因组DNA的制备 YAC载体系统：制备的基因组片段 10M bp * 染色体分带技术将各个染色体分离 ?载体系统：制备的基因组片段200 k bp *采用常规的基因组DNA的制备方法 当前第34页\共有92页\编于星期三\11点 2) 真核基因组DNA一级文库的构建（YAC文库） a) 染色体DNA的部分酶切 获得平均长度为200-500 kb的DNA片段 *多切点限制性内切酶：EcoR I，BamH I 特点：有较多重叠克隆子 *稀切点限制性内切酶：Not I，Mlu I 特点：重叠克隆子较少 当前第35页\共有92页\编于星期三\11点 b) 酶切片段与YAC克隆载体连接 YAC克隆载体 pYAC4 当前第36页\共有92页\编于星期三\11点 C) 酶切片段与载体连接 * 当前第37页\共有92页\编于星期三\11点 d)重组YAC载体转化酵母球形体 1? g基因组DNA 500个转化体 e) YAC文库的筛选 1）探针杂交法：以特异性的探针分子与 文库的克隆子进行杂交 2）PCR筛选法： 当前第38页\共有92页\编于星期三\11点 f)YAC基因组文库的保存 活化菌体：将含重组载体的阳性克隆（AB1380 菌株）划线接种于AHC平板上，于30 oC培 养至长出1-3mm的红色菌落。 短期保存：parafilm膜将平板周围封起来于4 oC 保存4-6周。 长期保存：接种一个单独的YAC克隆子于3 ml YPD培养基中，在30 oC摇床振荡过夜，然 后加入1ml 80%的甘油，混匀后分装于-80 oC保存。 当前第39页\共有92页\编于星期三\11点 3) 真核基因组亚文库的构建（? DNA载体的文库） 转导E.coli 当前第40页\共有92页\编于星期三\11点 4. cDNA文库的构建 cDNA文库：某种生物基因组转录的全部mRNA 经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库(cDNA Library）. 原理：将带poly（A）的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接. 当前第41页\共有92页\编于星期三\11点 1) 制备用于克隆cDNA的mRNA a)mRNA的制备 动物细胞mRNA的制备 植物细胞mRNA的制备 b)mRNA的来源 选用mRNA含量高的组