第六章基因操作中大分子的分离和分析详解演示文稿.pptVIP

3.1 Southern杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫DNA印迹杂交技术。由E. Southern 1975年设计，故又叫Southern DNA印迹转移技术。 印迹转移（blotting)：通过电泳将DNA、RNA或蛋白质样品进行分离，使不同相对分子质量的的分子在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品通过影印的方式转移到滤膜上的过程称为印迹。 当前第94页\共有150页\编于星期三\10点 Southern杂交流程图 样 品 制 备 电 泳 杂 交 转 膜 结果显示 探 针 制 备 当前第95页\共有150页\编于星期三\10点 （一）Southern杂交的操作步骤 1.预处理： （1）用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。 （2）将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。 （3）将电泳出来的凝胶泡在强碱溶液中，此时双链的DNA样品变性成单链DNA结构。 （4）用酸中和，使单链DNA维持其单链状态 （5）大片段DNA脱嘌呤，0.2N HCl。 2.原位转移： 将凝胶上的单链DNA转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上。（毛细管、电转移、真空转移） 当前第96页\共有150页\编于星期三\10点 当前第97页\共有150页\编于星期三\10点 当前第98页\共有150页\编于星期三\10点 当前第99页\共有150页\编于星期三\10点 3.固定： 在真空烤箱里，80℃下烤1-3h或紫外线照射或微波烘烤，将核酸样品进一步固定在滤膜上。 4.杂交： 杂交之前须有一个预杂交，封阻膜的背景，避免杂交时背景吸附探针。（鱼精DNA或脱脂牛奶） 将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。 当前第100页\共有150页\编于星期三\10点 5.漂洗： 将滤膜上没有和单链DNA样品结合的游离的探针分子漂洗下来，此后滤膜上只有杂交分子。 6.放射自显影： 在X光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。 7.比较鉴定： 将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的DNA分子是凝胶上DNA链的那个片段。 当前第101页\共有150页\编于星期三\10点 放射自显影 DNA印迹转移 探针杂交 － ＋ 当前第102页\共有150页\编于星期三\10点 Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交和杂交(放射性和荧光检测) 5.结果检测 当前第103页\共有150页\编于星期三\10点 Southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。 Southern杂交主要用于判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。（鉴定特定的目的基因） 当前第104页\共有150页\编于星期三\10点 当前第105页\共有150页\编于星期三\10点 当前第62页\共有150页\编于星期三\10点 当前第63页\共有150页\编于星期三\10点 1.5 脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PEGE） 1984年，D.C.Schwartz和C.R.Cantor发明。用来分离整条染色体这样的超大分子量DNA分子，如大肠杆菌染色体基因组DNA，4000kb。DNA分子的迁移方向随所用电场方向的周期性变化而不断改变。可成功分离到分子量高达107bp的DNA大分子。 当前第64页\共有150页\编于星期三\10点 脉冲场凝胶电泳实际上是一种交替变化电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使DNA分子在微观上按“Z”字形向前泳动，从而到达分离大分子DNA的目的。 与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1秒到5分钟左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。 脉冲场凝胶电泳的工作方式：横向交变电泳（TAFE）、场翻转凝胶电泳（FIGE）、旋转凝胶电泳和箝位匀场电泳（CHEF）。其中使用最广泛的是CHEF。 当前第65页\共有150页\编于