DB37_T 2794-2016沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 長东省地國方标准DB37/T2794—2016沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术Loop-mediated isothermal amplificationfor Salmonella typhimurium and Salmonella choleraesuis2016-07-29发布2016-08-29实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 2794—2016前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业科学院提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：黄保华、时建立、李俊、彭喆、刘畅、朱荣生、徐绍建、丛晓燕、杜以军、吴家强、孙文博。I DB37/T 2794—2016沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术1范围本标准规定了鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）和猪霍乱沙门氏菌（Salmonella本标准适用于疑似污染鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的各种样品检测，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验3材料3.1器材3. 1. 1微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL1000μL）3. 1. 220000g低温高速离心机3. 1. 3电热恒温水槽3. 1. 4稳流稳压电泳仪3. 1. 5水平电泳槽3. 1. 6凝胶成像系统3. 1. 7紫外透射反射分析仪3.1. 8电磁炉3. 1. 9烧杯（1000mL)3. 2试剂3. 2.15mol/LBetaine溶液：配制见附录A.13. 2. 2Bst DNA Polymerase (8U/ μ L)3. 2. 3SYBR GreenI核酸染料3. 2. 40.5XTBE缓冲液：配制见附求A.2。3. 2. 51%琼脂糖电泳液：配制见附录A.3.3. 2. 610mg/mL的溴化乙锭（EB）水溶液。3. 2. 7DNA Marker 2000.3. 2. 8超纯水：符合GB/T6682要求。3.3引物 DB37/T 2794—2016鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测引物：F3:5* CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG3B3:5-CGTGAGATATCGTCCAAAAGG 3*FIP: 5° GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTTGTACTGAGGCTAATTCACCAC 3BIP: 5° AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTTGTTTGTTTTTGATGATACAGGC 3猪霍乱沙门氏菌LAMP检测引物：F3:5° GGAGGAAGGTAGGGATGACG 3B3:5 CACTCCCATGGTGTGACG 3*FIP:5BIP:5CGGATTGGAGTCTGCAACTCGAGGAACGTATTCACCGTGGC 34方法4. 1样品处理及DNA的提取样品前处理及增菌按照GB4789.4-2010中5.1、5.2操作。取1mL增菌液放入1.5毫升EP管中，10000r/min离心2min，去上清：加入灭菌生理盐水1mL混勾，10000r/min离心2min，去上清：然后加灭菌双蒸水1nL混勾，，放入沸水浴中煮沸10min，取出后迅速效入冰块中，冷却5mnin，12000rpm，离心3min，吸上清液作为DNA模板，并保存于-20℃C备用。4. 2环介导等温扩增（LAMP）操作流程4. 2. 1环介导等温扩增反应体系配制按表1中1-8的循序配制。表1环介导等温扩增反应体系1TOJo.Iag1 X OT2. 5 μ L2dNTP混合液(10mo1/L)4. 0 μ LB3/F3 (5 μ no1/L)0. 15 μLX2BIP/FIP(50 = no1/L)1.5 μLX25Betaine (5no1/L)3. 0 μ L6DNA1. 0 μ L7Bst DNA Polymerase (8U/ μ L)1 μ L8翅纯水10. 2 μ L4.2.2LAMP程序设定每次LAMP均应设一个阴性对照（用超纯水作为模板），：具体参数见表2。表2LAMP反应程序设定温度时间163 °C鼠伤寒沙门氏菌60min猪崔乱沙门氏菌75min280C5nin2 DB37/T 2794—20164.3电泳操作4.3.11%琼脂糖凝胶板的制备称取0.6g琼脂糖，加入60ml0.5×TBE缓冲液中，加热融化，