免疫荧光技术观察肿瘤细胞骨架课件.pptxVIP

免疫荧光技术观察肿瘤细胞骨架;根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 ;异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC） ; 人宫颈癌上皮细胞 爬片（HeLa） 多聚甲醛固定液配法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 透化试剂： 900ML0.1MPBS中加入20×TritonX-100母液 100mL（终浓度为0.1%） 20×TritonX-100母液（10％）：180mL PBS中加入 20mL TritonX-100 至完全溶解 20×Tween-20母液（2％）：10mL PBS中加入0.2mL Tween20;一抗：小鼠抗人β-tubulin多克隆抗体，用时稀释了60倍。 二抗：羊抗鼠免疫球蛋白（FITC标记），用时稀释60倍 一抗稀释液：1mlPBS中加入0.02g牛血清白蛋白（BSA）粉末，溶解后加入20×Tween-20母液25～50μL（终浓度0.05%～0.1％）。 二抗稀释液：配法同一抗。;1．去除35mm Dish 中的培养基，用1ml PBS中洗一次，去除PBS. 2．多聚甲醛固定液中室温固定20分钟3. 于含0.5%TritonX-100的PBS中室温透化20分钟 4．PBS中清洗3次，每次3min。 5．用镊子小心将盖玻片夹起，放入事先铺好滤纸，并用PBS浸湿的一新 35mm Dish中间，滴加80ul 2％BSA封闭液室温温育20分钟6．用滤纸上吸至半干7．滴加30 ul一抗稀释液至细胞表面，恒温箱中温育37°C 60min9．PBS中洗三次，每次10min（摇床中进行）10. 滴加50ul荧光标记的二抗室温温育60min（避光）11．PBS洗三次，每次3min（摇床中进行） 12. DAPI染色5 min ，PBS漂洗1min 13．滤纸上吸干玻片上残余的液体，在干净载玻片上滴一滴封固剂，细胞面朝下盖于封固剂上，在载玻片上贴好，赶走气泡14．指甲油将盖玻片四周封好，避光保存待观察。;预备实验结果