NY_T 4043-2021CN中华蜜蜂囊状幼虫病诊断技术.pdf

ICS 11.220CCS B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 4043—2021中华蜜蜂囊状幼虫病诊断技术Diagnostic techniques for sacbrood disease ofChinese honeybee (Apis cerana cerana)2021-12-15发布2022-06-01实施中华人民共和国农业农村部5发布 NY/T 4043—2021目次前言引言范围2规范性引用文件3术语和定义4缩略语.5临床诊断5. 1感染特点5. 2箱外观察5. 3开箱检查5. 4流行特点5. 5结果判定实验室诊断6. 16. 2电镜法鉴定6. 3反转录-聚合酶链式反应扩增(RT-PCR)鉴定6. 4荧光定量PCR鉴定7综合判定7.1CSBV病原检测结果判定7.2CSBD检测结果判定附录A(资料性）中华蜜蜂囊状幼虫病附录B（资料性）溶液配制方法附录C(资料性)病毒粒子分离纯化附录D(资料性)PCR检测用引物和探针、反应体系及反应条件 NY/T 4043—2021色。后期虫体软化，大量的液体聚积于病虫驱体和未脱去的表皮之间，从巢房中拖出的病死幼虫量小囊状，含有大量病毒颗粒液体（见图A.3)，工蜂常将病死幼虫房盖咬一小孔或启开房盖，将死虫拖出巢房；没有被拖出巢房的死幼虫残留在巢房里，随虫体水分不断蒸发，干燥成一片黑褐色的鳞片，贴于巢房的一边，头、尾部略上翘，形如龙船状”。成年蜂也会被病毒感染，但症状表现不明显，图A.2患CSBD典型尖头“症状（杜桃柱等）图A.3患CSBD典型囊状（杜桃柱等）A.4流行特点CSBD的发生与气候、环境、蜜粉源、蜂种、蜂群的抵抗力以及蜂群的管理有关。恶劣的气候和环境、不充足的蜜粉源和不科学的管理技术是造成CSBD晕发的主要诱因，气候变化大、温湿度不稳定、蜂群又处于紫殖期时容易发病。温度低、温差大、蜂箱保温差等条件下易发病，特别是早春寒流表击后，病害发展迅速。病害流行与食物也有关，当蜂群子脾大时，一且缺乏饲料，幼虫营养不足，体质下降，抵抗力也下降，此时极易发生病害。夏、秋季节，蜂王减少产卵，幼虫数量相对较少，群内饲料较足，幼虫饲喂好，发育健壮，蜂群不易发病。 NY/T 4043—2021附录B(资料性)溶液配制方法B. 1磷酸盐缓冲液B. 1. 10.2mol/L磷酸氢二钠水溶液取十二水磷酸氢二钠(NazHPO，·12H,O)71.6g或二水磷酸氢二钠(Na:HPO,·2H,O)35.6g，加蒸馏水定容至1L，B.1.20.2mol/L磷酸二氢钠水溶液取磷酸二氢钠(Na;HPO，·2H;O)31.2g,加薰馏水定容至1LB. 1.30.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液取0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液28mL,0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液72mL配成0.2mol/LPB溶液。取50mL0.2mol/LPB溶液，加蒸编水稀释至1L,调pH至7.2。B. 1.4灭菌保存在121C温度下高压灭菌15min，冷却后无菌条件下加人青霉素、链需素各10000U/mL，配制好的暖冲液保存在4C冰箱中，B.20.03mol/L磷酸缓冲液取0.2mol/LpH7.2的磷酸盐溶液15mL，加去离子水定容至100mL,121C高压灭菌15min，冷却备用。B.3DEPC水用超纯水按0.1%加人DEPC，室温静置过夜，115℃高压灭菌20min，冷却备用。B.41.0%琼脂糖凝胶琼脂糖0.3 g1XTAE缓冲液30 mL加热落解，冷却到50℃~60C时加入5μLGelRed核酸染料，倒入胶槽内自然凝固。B.5蔗糖梯度溶液分别称取蔗糖1g、1.5g、2g、3g，加1×PBS溶液充分落解并定容至5mL，配制成浓度分别为20%、30%40%.60%(W/V)的蓝糖溶液。B.6PCR电泳需要的溶液及配方B.6.150×TAE缓冲液Tris242 gEDTA18. 61 g冰乙酸57. 1 mL加人800mL去离子水，充分搅拌均匀，用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L室温保存备用。8 NY/T 4043—2021B. 6. 21×TAE缓冲液取50×TAE缓冲液20mL.加去离子水定容至1L，得到1X×TAE缓冲液，用于PCR电泳及琼脂糖凝胶配制。 NY/T 4043—2021附录C(资料性)病毒粒子分离纯化C.1中华蜜蜂囊状幼虫病毒粒子纯化步骤中华蜜蜂囊状幼虫病毒粒子纯化步骤如下：a)将患病幼虫迅速于液氮中研磨后，转移至15mL离心管，加入适量PBS于37℃、200g水浴振荡器中振荡1h；b)将溶液取出后加入0.5mL氧伤，于冰上涡旋1h；c)将溶液于离心机中12000g4℃离心1h，取上清液.弃沉淀；d)将收集的上清于75000g4℃C离心3h，弃上清液，用PBS重悬沉淀，4C过夜