DB37_T 2038-2012牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程.pdf

ICS 65. 020. 30B 41DB37山東东省地方标准DB37/T尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程Technical specification of detection for deficiency of uridine monophophate synthasein bovine2012-02-09发布2012-03-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 2038—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司.本标准主要起草人：李荣岭、张思聪、王洪梅、李秋玲、李建斌、黄金明、志花、王长法、侯明海、曲绪仙、仲脐峰。I DB37/T 2038—2012附录C（资料性附录）血液中DNA的提取方法C.1取1mL全血融化，加入等体积PBS缓冲液C.2混匀10min，12000rpm离心5min，弃上清，重复3次。加入500μL抽提缓冲液，悬浮沉淀加入RNaseA终浓度20μg/mL，37°C水浴1h.C.3加入蛋白酶K，其终浓度为100μg/mL，56C水浴温和振荡，消化完全，至不见粘稠团块C. 4加入等体积Tris饱和酚、温和顺倒混合至少5min，12000rpm、4℃离心8min：取上清，同上重复抽提。C.5取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24：1)混合液，同上，重复抽提；取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），同上，重复抽提。C. 6取上层水相，加入等体积的异丙醇（-20C），沉淀DNA，水平轻摇即可看到絮状DNA沉淀，12000rpm、 44℃离心2 min.C. 7加入1mL75%的冰乙醇（-20℃）洗涤DNA沉淀2次，12000rpm、4C离心3min。C. 8小心倒掉乙醇，用吸水纸残留的乙醇，将离心管倒扣于纸巾上，置于37℃温箱干燥15min。C. 9待乙醇完全挥发（注意不要太干），加入100-200μLTE溶解，4℃保存。 DB37/T 2038—2012附录D（资料性附录）冷冻精液DNA的提取D.1将冻精细管从液氮罐中取出，37℃C水浴快速解冻，收集精液至1.5ml离心管中，加入1mL缓冲液清洗，8000rpm离心5min，弃上清，重复3次.D. 2加入500μL抽提冷冻精液缓冲液悬浮沉淀物，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，混匀，于37C消化4h。D. 3加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提，12000rpm、4C离心12minD. 4将上清用氯仿：异戊醇(24:1)抽提，12000rpm、4C离心12min。D. 5取上清，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃），沉淀DNA，12000rpm、4℃离心2minD. 6加入1m75%的冰乙醇（20℃）洗涤DNA2次.D. 7小心倒掉乙醇，用吸水纸残留的乙醇，将离心管倒扣于纸巾上，置于37C温箱干燥15min。D. 8待乙醇完全挥发，加入100-200μLTE溶解，4C保存，10 DB37/T 2038—2012附录E（资料性附录）聚丙烯酰胺凝胶电泳E.1凝胶板的制备清洗制胶玻璃板，用蒸馏水清洗干净，擦干后，用夹子夹好。E.2聚丙烯酰胺凝胶的配置量取30%丙烯酰胺（49：1）溶液10.0ml，5×TBE5.0mL，10%过硫酸铵0.18mL，TEMED0.016mL，混匀。E.3灌胶将玻璃模具倾斜，将胶缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至注满模具顶部，避免产生气泡。E.4插梳立即插入相应的点样梳，将胶板水平放置，室温静置20-60min以待凝胶聚合，在此过程中，添加少许凝胶，以避免凝胶在聚合过程中的回缩。E.5预电泳凝胶聚合后，撤掉底达的过条，将胶板夹到电泳槽上，并在潜中加入1×T的电泳液，用注射器冲洗加样孔，清洗尚未完全聚合的残胶。用180V电压预电泳10min。E.6上样将样品与上样缓冲液按6：1混合，加样于点样孔，并加入DNA分子量标准的DL2000Marker。做较多样品检测时，可在不同板中将arker加样于不同位置，以将板区分开，避免样品的混清。E.7电泳根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小决定电泳的电压及电泳时间，电压通常是18V/cm，电泳时间3~4h。E.8染色电泳结束后，取下电泳胶板，小心取下一面玻璃，将附有凝胶的玻璃板悬于染胶盘上方20～30cm，使凝胶期下，用胶条小心起凝胶一角，使凝胶轻轻放入染胶盘内，将胶用双蒸水中漂洗2次，每次10一11 DB37/T 2038—201220s：经10%乙醇固定10min，双蒸水中漂洗2次；加入1%AgN0银染，避光轻摇染色30min，双蒸水漂