DB37_T 3995-2020松花粉多糖实验室提取技术规程.pdf

ICS62. 020. 01B05DB37山長东省地電方标准DB37/T3995—2020松花粉多糖实验室提取技术规程Technical specification for laboratory extraction of pine pollen polysaccharides2020-06-08发布2020-07-08实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 3995—2020前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、黄河、胡莉萍、杨萍萍、楚遵锋、刘宴博、崔莉、汪洋、徐启杰、陈峰。I DB37/T 3995—2020松花粉多糖实验室提取技术规程1范围本标准规定了松花粉中松花粉多糖的实验室提取及测定方法。本标准适用于松花粉中松花粉多糖的提取和测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯。3.1水：符合GB/T6682的规定的三级水3.2乙醚3.3胃蛋白酶。3.4Sevag试剂，配制方法见附录A。3.5无水乙醇。3. 6磷酸盐缓冲溶液（PBS），配制方法见附永A3.7葡萄糖对照品，纯度≥99%。3.8浓硫酸。3. 9苯酚。4仪器设备4. 1260目筛网。4.2恒温干燥箱。4. 3超微粉碎机。4.4电子天平：精度0.001g4.5索氏提取器。4.6水浴锅。4. 7高速离心机：转速不小于16000r/min4.8旋转蒸发仪。4.9真空干燥器。4.10移液器：10μL~1000μL.4. 11振荡器。 DB37/T 3995—20204.12分光光度计：波长范围380nm~780nm4.13pH 计。5松花粉的准备于每年四、五月份采集松树的花粉，过260目筛网筛除杂质，放入恒温干燥箱中于70℃烘干，用超微粉碎机破壁。泰山松花粉多糖的提取6.1除脂破壁松花粉用脱脂滤纸分装成20g独立小包，置于索氏提取器中，用乙醛回流抽提脂肪4h，将除脂后的松花粉收集到烧杯中。6. 2漫提将除脂的松花粉与去离子水按1:10比例置于1000mL烧杯中混合均勾，并加入0.3%的胃蛋白酵。将烧杯置于恒温水溶锅中，于50C让松花粉与胃蛋白酵充分反应2h，然后在85C浸提8h使多糖充分落出。浸提过程中随时添加去离子水补充蒸发的水分，每30min搅拌1次.漫提完置于4℃冰箱过夜沉淀。6.3过滤将没提液用四层纱布过滤去掉杂质，然后将上清用离心机在8000rpm条件下离心10min，得上清，分装到1000mL量程的烧杯中。6.4浓缩将得到的上清液用真空旋转蒸发器浓缩至1/4体积：6.5除蛋白沙维积（Sevag）试剂（附录A）与浓缩液1:5混合后置于振荡器上在250rp～300rpm条件下震荡30min，再在5000rpm～8000rpm条件下震荡15min，然后用高速离心机在10000rpm条件下离心，弃掉下层溶液和中间蛋白层，保留上层多糖落渡。该步骤重复2次以上，6.6沉淀多糖将除蛋白后的多糖溶液缓慢加入到四倍量无水乙醇中，置于-20℃冰箱让多糖沉淀过夜，弃上清，保留多糖沉淀于烧杯中。6.7干燥多糖经真空干燥器干燥后得精制松花粉多糖（待测多糖）。7多糖含量测定7.1标准曲线的制作 DB37/T 3995—2020取8支干净的带塞试管，按表1方法分别加入相应体积的葡萄糖对照品溶液（附录A），然后在冰水溶中加入0.5的6%苯酚溶液（附录A），震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇勾后恒温加塞，沸水中放置20min，取出后用凉水冷却10min，以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（μg/mL），吸光度Y为纵坐标，绘制曲线，即为标准曲线。用Exce1软件求得回归方程。表1标准曲线的制作的试剂配制方法管号0-234葡萄糖(nl.)0. 0 0, I0. 20. 30, 40. 50. 60. 7苯酚液(nl.)0. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 5浓硫酸(nl.)3. 03. 03. 03. 03. 03. 03. 03. 07. 2结果计算将提取得到的干燥精致松花粉多糖用水溶解，定容至100mL，取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以葡萄糖溶液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘以换算系数，既得待测多糖含量。7. 3结果判定用苯酚-硫