DB37_T 2311-2013牛结核病γ干扰素酶联免疫吸附试验.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 長东省地方标准DB 37/T结核病干扰素酶联免疫吸附试验诊断技术Diagnostic Criteria on Bovine Tuberculosis by Enzyme-linked Immunoassay of-interferon2013-04-01发布2013-05-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国兽医药品监察所、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：杨宏军、高运东、丁家波、田夫林、何洪彬、张亮、宋玲玲、侯佩莉、侯明海、仲脐峰。I DB37/T 2311—2013牛结核病Y干扰素酶联免疫吸附试验诊断技术诊断技术1范围本标准规定了牛结核病干扰素ELISA诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、检测方法、结果判定和操作注意事项等。本标准所规定的技术适用于牛感染结核分枝杆菌或牛分枝杆菌时干扰素的检测，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T18645-2002动物结核病诊断技术GB19489-2008实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3. 1牛结核病bovinetuberculosis由牛分支杆菌（Mycobacteriumbovis）或结核分支杆菌（M.tuberculosis）所引起的一种人备共患的慢性消耗性传染病，可通过病畜传染给人和其它动物。3. 2干扰素Y-InterferonT淋巴细胞受到结核杆菌抗原刺激后释放的细胞因子，作为重要的巨噬细胞活化因子，在对结核分技杆菌的免疫应客中发挥重要的作用，可通过干扰素的检测来实现对结核杆菌感染的诊断。4试剂及仪器4.1试剂4.1.1血液培养所需材料血液培养所需材料见附录A。4. 1. 22ELISA所需试剂ELISA所需试剂见附永B DB37/T 2311—20134.2仪器检测所需仪器：a)37℃培养箱：b)精密可调移液器 (1 nL) :c) 1 nlL、 5 ml、I10ml的移液器：d)100mL、1L、2L的量简：e)6L去离子水或蒸馏水；f)12道移液器（50μL300L）;g)微量振荡器（可选）：h)洗板机：i)酶标仪（含450nm和650nm滤光片）。5检测方法（干扰素ELISA诊断方法）5. 1试剂配制检测所需试剂及制备方法按附录C的规定。5. 2检测步骤5. 2. 1全血培养5. 2. 1. 1采血将采集的血液（至少5叫L）放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解，室温（22±5℃）下运送到实验室并在采血后30h内进行培养，运送和储存过程中切勿冷冻血液，5. 2. 1. 2血液分装分装前轻轻颠倒试管，充分混匀血液样品。将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加三管1.5mL分装的抗凝血（见表1）。用一次性自动移液器或吸管在无菌条件下进行操作。表1吸取血液或抗原至24孔培养板的推荐操作1号动物NIL. A1AvPPD A2BoPPD A3NIL A4AvPPD A5BoPPD A62号动物3号动物NIL. B1AvPPD B2BoPPD B3NIL B4AvPPD B5BoPPD B64号动物5号动物NIL C1AvPPD C2BoPPD C3NIL C4AvPPD C5BoPPD C66号动物7号动物NIL D1AvPPD D2BoPPD D3NIL D4AvPPD D5BoPPD D68号动物注：NIL=阴性对照抗原（无菌PBS）：AvPPD=禽型提纯结核菌素；BoPPD=牛型提纯结核菌素5. 2. 1. 3加入刺激抗原5. 2. 1. 3. 1无菌加入100μLPBS（阴性抗原对照），禽PPD或牛PPD至相应的孔5. 2. 1. 3.2抗原应与分装的血液充分混匀，用微量振荡器高速握荡1min：如果没有合适的仪器，应将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转10次。2 DB37/T 2311—20135.2.1.4孵育将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16h～24h。5. 2. 1. 5血浆样品的收获用可调移液器小心吸取约400且的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。污染极少量红细胞不会影响-干扰素酶免疫试验。5.2.1.6血浆的贮存血累可在28C忙存7天，在-20它可些存几个月。些存前，每个些存管必须用合适的盖子密封。应在