DB37_T 3624-2019牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测技术规程.pdf

ICS11.220B 41DB37山長东省地方标准DB37/T3624—2019牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测技术规程Detection of Mycobacterium tuberculosis complex pathogenic organisms in aerosolof cattle farm by Real-time PCR2019-07-23发布2019-08-23实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T次前言1范围.2规范性引用文件3术语和定义4缩略语5原理.6材料及设备6.1试剂，6.2仪器设备7生物安全措施8气溶胶样品的采集、保存及运输8.1气溶胶样品的采集8.2气溶胶样品的采集后的灭活处理8.3样品的保存和运输9操作方法，9.1气溶胶样本的前处理9.2核酸提取9.3荧光定量PCR检测10分析条件设定和结果判定10.1阔值设定.10.2质控.10.3结果分析及判定11注意事项A（资料性附录）主要仪器设备附（规范性附录）牛场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项附永（资料性附录）气溶胶结核分枝杆菌复合群核酸荧光定量PCR检测结果图附D（规范性附录）检测过程防止交叉污染的措施 DB37/T 36242019985-59tis38Temepeahns (C)说明：结核分枝杆菌复合群核酸阳性的熔解曲线Tn值为：(92. 5± 0. 5) C,图C.3结核分枝杆菌复合群核酸阳性结果熔解曲线 DB37/T录D（规范性附录）检测过程防止交叉污染的措施D.1样品采集与运输D.1.1采样采集采集样本使用独立的气溶胶采样器和收集管。一个气溶胶采样器限于采集一份样本，收集管使用次性灭菌离心管，防止不同样品之间通过采样器、收集管交叉污染。D.1.2样本运输与贮存防止样品在运输与贮存过程中包装损坏造成交叉污染D.2检测过程PCR反应试剂应按检测需求分装贮存，避免同一管试剂多次开启使用。装有核酸模板、PCR试剂和引物的离心管在打开之前，应短暂离心，所有操作尽量避免产生气落胶。上机运行前，应检查并盖紧各PCR管。D.3人员要求采样人员穿一次性无菌隔离服，戴一次性手套和口罩。实验室检测人员应由具备资格的工作人员操作。D.4用具灭菌气溶胶采样器清洗干净后121℃高压灭菌处理20min.D.5仪器设备与耗材使用带滤芯吸头。吸头、离心管、PCR管等应一次性使用，不得回收清洗后重复使用。D. 6实验室实验室应该设有核酸提取工作区、PCR加样工作区以及灾光定量PCR仪放置区，不同区域可密闭进行紫外消毒，并配备Ⅱ级生物安全柜A型。上述区域在每次使用后应及时清清处理，并在使用前后照射紫外30min以上。每个区域应有专门的废弃物容器，该容器应能耐受煮沸、70%乙醇溶液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理废弃物及消毒容器，并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒。D.7其他 DB37/T遵循核酸检测实验室其他技术要求，10 DB37/T 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草，本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东师范大学。本标准主要起草人：王洪梅、何洪彬、赵贵民、侯佩莉、淄伟、何成强、于志君。1I DB37/T 3624—2019牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测技术规程1范围本标准规定了牛场环境气溶胶样本中结核分枝杆菌复合群核酸实时荧光定量PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于牛场环境中气溶胶结核分枝杆菌复合群核酸的快速准确检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1Ct值Cycle Threshold荧光信号量达到设定的阅值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。MTC：结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、非洲分枝杆菌（M.africanum），坎纳分支杆菌（M.canettii）等（Mycobacteriumtuberculosiscomplex)AGI：全玻璃液体冲击式采样器（Al1-Glass-Impinger）5原理本标准采用SYBRGreenI染料实时荧光定量PCR技术MTC细菌的分泌性蛋白MBP70基因非常保守，因此以它为目的基因设计引物，可以对结核病病原进行