DB64 965_2014食品中鸡、鸭源性成分定性检测方法实时荧光PCR法.pdf

ICS 67. 050X 04DB64宁夏回族自治区地方标准DB 64/T 9652014食品中鸡、鸭源性成分定性检测方法实时荧光PCR法Identification of chicken and duck derived materials in foodReal-time PCR method2014-07-18发布2014-07-18实施宁夏回族自治区质量技术监督局发布 DB64/ T 9652014前本标准参照SN/T2051-2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》制定。本标准编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导购第1部分：标准的结构和编写》的要求。本标准由宁夏回族自治区质量技术监督局归口。本标准由宁夏国族自治区食品检测中心起草本标准主要起草人：岳苑、郭晓明。 DB64/ T 9652014食品中鸡、鸭源性成分定性检测方法实时荧光PCR法范围本标准规定了食品中鸡、鸭源性成分实时荧光PCR检测方法，本标准适用于肉及肉制品中鸡、鸭源性成分的定性检测。该检测方法的检出限为0.1%。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（色括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27025-2008检测和校准实验室能力的通用要求GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语下列术语和定义、缩略语适用于本标准。3.1术语和定义3. 1. 1鸡源性成分chicken-derivedmaterials鸡种属特异性DNA片段。3. 1. 2鸭源性成分duck-derivedmaterials鸭种属特异性DNA片段。3. 1. 3实时荧光PCRRrealtime fluorescent PCR实时荧光聚合酶链式反应。3. 1. 4Ct 值 Cyole threshold Ct每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数， DB64/ T2缩略语DNAdeoxyribonuleicacid脱氧核糖核酸。PCRpolymerise chainreaction聚合酶链式应。Taq：Thermusaquaticu水生栖热菌。FAM 66-carboxyfluorescein6-羧基荧光素。4原理本标准采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类鉴定。本标准应用荧光检测技术鉴别鸡、鸭源性成分，通过标记荧光物质(FAM)的特异性探针进行特异性扩增。内参照(InternalContro1)同时进行扩增，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对肉制品中鸡、鸭源性成分进行快速检测。仪器设备5. 1实时荧光PCR检测系统。5. 2高速冷冻离心机(转速12000r/in以上)。5.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。冰箱(2℃~8℃和20℃或80℃)5.5微量可调移液器：0.5uL～10μL，10uL~100μL，20μL200μuL，100μL~1000uL。5.6恒温加热器。5. 7可移动紫外灯。5.8分析天平（感量0.1mg）。5.9高压灭菌锅。5. 10干热灭菌器。6材料及试剂6: 16.1.1实时荧光PCR反应管。6.1.2微量可调移液器配置吸头：10uL，200uL，1000uL6. 1. 3离心管。6.2试剂除特别说明以外，所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682-2008规定的一级水，所有试剂均用无DNase污染的容器分装。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T27025-2008的规定。6.2.1基因组DNA提取试剂盒：提取步骤及使用注意事项参见附录A。6.2.2荧光定量PCR反应预混液；使用方法及使用注意事项参见附录B.1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。知其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 DB64/ T2.3引物及探针6.2.3.1鸡源性成分引物：5tgaacctaagcttcttcgaccaa3*5*atcggtttcctggtgatgga3*探针：FAMcaagcccctgcctactaggaatccctcTAMRA6.2. 3.2鸭源性成分引物：5ggcctcctactggctatgca3*5*-gagtcagccatattggacgtft3*探针：FAcaccgcagacacatcccttgctttctTAMRA6.2.3. 3内参照引物：5-gttcgtttgttcaacgattaa3*5*agatagaaaccgac