GA_T 1965-2021CN法庭科学 硅藻rbcL基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法.pdf

ICS 13.310CCS A 92GA中华人民共和国公共安全行业标准GA/T 1965—2021法庭科学硅藻rbcL基因特异片段检测毛细管电泳荧光检测法Forensic scienceMethods for detection of rbcL gene of diatom-Capillary electrophoresis and fluorescence method2021-10-14 发布2022-05-01实施中华人民共和国公安部发布 GA/T言本文件按照GB/T1.1—2020≤标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规划》的规定起草，请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任，本文件由全国事技术标准化技术委员会(SAC/TC179)提出并归口。本文件起草单位：广州市刑事科学技术研究所、中山大学、广东省公安厅，本文件主要起草人：刘超、徐曲毅、刘宏、赵建、肖成、李越、汪冠三、刘长晖、杨幸怡、徐际超。 GA/T 1965—2021法庭科学硅藻rbcL基因特异片段检测毛细管电泳荧光检测法1燕围本文件规定了法医物证检验水中户体组织中硅藻的材料准备、操作方法、聚合降链式反应(PolymerasechainReaction，PCR)扩增硅藻叶绿体核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶大亚基基因特异片段和实时荧光定量检验结果判定及注意事项，本文件适用于法庭科学检验中对硅藻rbcL基因片段的检验。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款。其中，注目期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)透用于本文件。GA/T 382—2014法庭科学DNA实验室建设舰范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1rbeL基固rbeL gene叶绿体核酮糖-1，5-二磷酸发化酶大亚基基因，4原理在溺死过程中，肺泡-毛细血管屏障损伤导致水中的浮游生物（如硅案)随溺液进人血液循环，从面到达人体内各器官，检测这些浮游生物的存在，可用于诊断满死，溺死相关硅藻（舟形藻、菱形藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻、骨条藻等)的叶绿体中含有rbcL基因，该基因片段与人类及共生菌没有同源性。在水中户体的体循环器官（肝脏或肾脏)中检测到该基固的待异片段，可证实溺死相关硅藻脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)的存在。仅器设备包括：a)可调微量移液器(2μL、10μL、100μL、1000μL);b)高速台式冷冻高心机，可控温至4C且高心速度可达12000r/min以上；c)PCR扩增仪，d)实时荧光定量PCR扩增仪；e)毛缩管电泳仪； GA/T 1965—2021f)超净工作台；g)高压灭菌锅；h)涡旋仪。6试剂耗材6.1DNA提取试剂，以Powersoil土振DNA提取试剂盒为例：a)细胞裂解液，书温保存；b)石英砂，常温保存；c)20mg/mL蛋白酶K，4C保存；d)抑制因子去除溶液，常温保存；e)蛋白沉淀溶液，常温保存；f)DNA结合盐溶液，常温保存；g)硅膜离心纯化柱，常温保存；h)乙醇冲洗液，常温保存；DDNA溶解液，常温保存，6.2参考SYBRGreen实时荧光定量PCR扩增试剂及引物：a)rbcL(F):5CTCAACCATTCATGCG 3,b)rbeL(R) :5° CTGTGTAACCCATAAC 3′,c)SYBRGreenPreMix荧光染料预混酶；5U/μL，一20C保存，6.3参考PCR-CE扩增电泳试剂及引物：a)rbeL(F) :5FAM- CTCAACCATTCATGCG 3′;b)rbcL(R) : 5CTGTGTAACCCATAAC 3′;c)PCR PreMixTaq酶;5U/μL,—20C保存;d)甲酸胺；e)分子量内标(75bp~500bp);fPOP-4 胶;g)纯水；h)透明薄壁PCR管(0.2mL)；i)96孔微孔板；j)离心管(0.5mL和2 mL)。7实验室环境要求符合GA/T382—2014的要求。8操作步吸8.1样本准备8, 1.1剪取户体的肺、肝、肾样本各0.5g，加人600μLDNA提取裂解液，匀浆裂解。8.1.2样本匀浆裂解液，按照DNA提取试剂盒使用说明提取DNA，调整DNA质量浓度至0.5ng/μL～1.0ng/μL，20C分装保存待检，2 GA/T 1965—20218.2实时荧光定量PCR检测0.5μL,DNA模板2μL,纯水7μL.反应参数见附录A中A1，8.3PCR-CE毛细管电泳分离检测8.3.1样品PCR准备8.3.1,1取出冷藏的PCR-CE扩增试剂使其温度达到室温，轻弹混匀、离心，8.3.1.2准备扩增样品、阳性对照