DB37_T 4047-2020猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 長东省地方标准DB37/T4047—2020猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法Detecting porcine circovirus 3 with polymerase chain reaction2020-07-09发布2020-0809实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 4047—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：李俊、时建立、喆、徐绍建、吴晓燕、刘畅、李琛、孙文博、于江、丛晓燕、韩红、吴家强、杜以军、陈智。I DB37/T 4047—2020猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒3型（PorcineCircovirusType 3，Pcv3）的聚合酶链反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）试验方法。本标准适用于猪圆环病毒3型的快速诊断、检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541—2016善医诊断样品采集、保存与运输技术规范3原理聚合酶链反应或多聚链反应（PolymeraseChainReaction，PCR），又称无细胞克隆技术，是种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性一-退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上。每完成一个循环需2min~4min，2h3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。4试剂和材料4.1水：GB/T 6682，—级水。4.2蛋白酵K溶液（20g/mL）：配制见附录A.14.310%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录A.2。4.4Tris平衡酚。4.5三氯甲烷。4.6无水乙醇。4.770%乙醇：配制见附录A.3，4.80.5XTBE缓冲液：配制见附录A.4。4.9电泳级1%琼脂糖：配制见附录A.5。4.10DNA核酸染料。4.11 DNA Marker 2000.4.12引物：P1: 5TACCACAGAAGGCGCTATGTCG3′: DB37/T2: 5*ATCCGCATAAGGGTCGTCTTGC3仪器设备5. 1电子天平：感量为0.001g.5. 2微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL）。5. 3低温高速离心机。5. 4PCR 仪-5. 5稳流稳压电泳仪。5. 6水平电泳槽。5. 7凝胶成像系统。6样品6. 1样品采集按NY/T541一2016无菌采集血清或猪淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织。6. 2样品处理6.2.1血清直接用于DNA提取。6.2.2淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织各1g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1：5倍稀释，取悬液反复冻融3次，5000g离心15min，取上清液-20C保存备用。1操作步骤7. 1病毒DNA的提取7. 1. 155 ℃水浴 2 h~~3 h.7. 1. 2加入200μLTris平衡酚，混勾，4℃12000g离心15min7. 1. 3取上清液500μL，加入200μLTris平衡酚和200μL三氯甲烷，4℃C12000g离心15min7. 1. 4取上清液400μL，加入200μL三氯甲烷，4℃12000g离心15min。7. 1. 57. 1. 6弃上清液，加入1。70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。7. 1. 7加入20μL灭菌一级水溶解沉淀，-20℃保存备用。7. 2聚合酶链式反应（PCR）操作流程7. 2. 1PCR反应体系配制按表1中1-7的循序配制。表1聚合酶链式反应体系110X反应缓冲液5. 0 μL2dNTP 混合液(10 mo1/L)4. 0 μ L2 DB37/T1聚合酶链式反应体系（续）3P1 (10 μnol/L)1. 0 μ 1.4P2(10 μnol/L)1. 0 μ L5DNA4. 0 μ L6TaDNA 聚合酶(8 U/ μ L)1. 0 μ 1.灭菌水补足至总体积50.0μL7. 2. 2PCR程序设定每次PCR均应设一个阳性对照和阴性对照（用灭菌水作为模板），具体参数