DB37_T 3123-2018梧桐花黄酮的提取及其生物活性评价技术规范.pdf

ICS 67. 050X 04DB37山 東东省地國方标准DB37/T3123—2018梧桐花黄酮的提取及其生物活性评价技术规范Technical Guideline of Phoenix Tree Flower Flavonoid Extraction and Its BiologicalActivity Evaluation2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3123—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准由山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心负责起草，本标准主要起草人：朱瑞良、胡莉萍、魏凯、孙振红、黄河、郝智慧、自振贵、王非，I DB37/T桐花黄酮的提取及其生物活性评价技术规范1范围本规范规定了梧桐花黄酮的提取及其生物活性评价的术语和定义、试剂或材料、仪器设备、梧桐花黄酮的提取、黄酮含量的测定、生物活性评价等标准，本规范适用于梧桐花作为动物用免疫佐剂和免疫增强剂的相关产品。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T24863—2010畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1抑菌圈 bacterial inhibition ring是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈。根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价。3. 2最小抑菌浓度minimum inhibitory concentration, MIC在特定环境下孵有24h，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度，即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性3. 3细菌毒力bacterial virulence表示病原体致病能力的强弱，是菌体对循主体表的吸附，向体内侵入，在体内定居、生长和紧殖，向周围组织的扩展蔓延，对宿主防御功能的抵抗，以及产生损害宿主的毒素等一系列能力的总和。3. 4组织细胞半数感染剂量50%tissue culture infective dose，TCID又称50%组织细胞感染量，即指能在半数细胞培养板或试管内引起细胞病变（cytopathiceffect，CPE）的病毒量。1 DB37/T 312320184试剂或材料4. 19日龄SPF鸡胚。4. 2DMEM细胞培养液.4.3胰蛋白酶。4.4胎牛血清。4.5芦丁标准品。4. 6无水乙醇、正丁醇。4. 7去离子水。4. 8生理盐水。4. 9营养琼脂培养基。4. 10营养肉汤培养基。仪器设备5. 1索氏提取器。5. 2旋转蒸发仪。5. 3电子天平5. 4120目筛。5. 5恒温振荡培养箱。5. 696孔细胞培养板。5. 7分光光度计。5. 8恒温干燥箱。5. 9恒温培养箱。5. 10灭菌锅。5. 11二氧化碳培养箱。5.12打孔器（7m孔径），5.13试管（10 mL 体积）。5. 14烧杯（1000mL体积）。5. 15光学显微镜（目镜10×，物镜40×）。6梧桐花黄酮的提取6.1将采集的梧桐花置于干燥箱中60℃干燥，粉碎，过120目筛。6. 2称取1kg梧桐花粉末（分为若干份）置于索氏提取器中，用12倍60%乙醇回流提取3次，每次2 h.6. 3合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩，得乙醇租提物6.4取乙醇租提物用6倍正丁醇落解萃取，萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩，即为梧桐花总黄酮提取物，7梧桐花黄酮含量的测定7.1精确称取芦丁标准品30g，用95%乙醇溶解，定容于100ml容量瓶中，摇匀即得浓度为0.3mg/mL的芦丁标准储备液。2 DB37/T 3123—20187.2经过标准液显色后用1cm比色Ⅲ在波长400nm~700nm区间进行紫外扫描，确定在510nm处最大吸收波长，7.3分别吸取上述产丁储备液0、1.00ml、2.00mL、3.00ml、4.00mL、5.00mL于6个25mlL的量瓶中，加入5%的NaNO:溶液1.0mL，摇勺、静置5min。7.4加入10 %的A1(NO,)落液1.0 mL，摇匀、静置5 min7.5加入1.00mo1/L的Na0H溶液5.0nL并摇匀，用95%乙醇溶液定容，静置10min。7.6于波长510nm下测定吸光度，试剂空白为参比液，绘制标准曲线。采用最小二乘法进行回归分析，得回归方程4=0.01377c十0.0012（R2=0.9995，A为吸光值，c为梧桐花总