LY_T 2347-2014刚竹属DNA扩散片段长度多态性（AFLP)分析方法.pdf

ICS 65.020.20B 65LY中华人民共和国林业行业标准LY/T 2347—2014刚竹属DNA扩增片段长度多态性（AFLP）分析方法Method of DNA amplification fragment length polymorphism (AFLP)forPhyllostachys bamboo2014-08-21发布2014-12-01实施国家林业局发布 LY/T 2347—2014前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起章，本标准的附录为规范性附录。本标准由全国竹藤标准化技术委员会(SAC/TC263)提出并归口。本标准起草单位：国际竹藤中心、北京林业大学、中国林业科学研究院亚热带林业研究所。本标准主要起草人：李雪平、高志民、牟少华、陈数、衰金玲。 LY/T竹属DNA扩增片段长度多态性（AFLP）分析方法1范围本标准规定了刚竹属（Phyllostachys)竹种的DNA提取、酶切、连接、扩增实验步骤及采用的仪器设备。本标准适用于刚竹属竹种DNA多态性的分析。2试剂2.1所用化学试剂如没有特殊说明，均为分析纯。2.2DNA提取液;1mol/LTris-HClpH8.2、细胞裂解液(1mol/LTris-HClpH7,5,0.25 mol/L EDTApH8.0,5mol/L氯化钠，2%CTAB)与5%SLS按5：5：2混合，在使用前加人亚硫酸钠至终浓度为0.02mol/L,2.3三氟甲烷：异戊醇=24：1。2.4异丙醇。2.570%乙醇：70mL无水乙醇加蒸馈水定容到100mL，2.65mol/L氧化钠：称取29.22g氧化钠，用蒸馈水溶解后定睿到100mL。2.72.8变性缓冲液：去离子甲酰胺50mL,EDTA(0.5mol/L，pH=8.0)1mL，二甲苯青FF0.125g，溴酚蓝0.125g.2.910XTBE;Tris 108.0 g,酮胶 55.0 g,0.5 mol/L EDTA(pH8.0)40 mL,定容到1 000 mL。2.1040%内烯酰胺溶液，2.0g甲叉双内烯酰胺，38.0g丙烯酰胺混合加水定容到100mL。2.1110%过瓷酸胺溶液：1.0g过硫酸胺加水定容到10mL。3仪器3.1PCR仪(具有touchdown功能，温度精度±0.2C)。3.23.34C低温离心机(max14000r/min以上）。3.4水浴锅。3.5电泳仪(可满足DNA测序）。3.6紫外分光光度计。3.7分析天平。3.8摇床，试验步聚4.1DNA提取按照附录A的方法提取和检测竹子基因组DNA。电泳检测DNA主带完整、平均分子量20kb； LY/T 2347—2014纯度为1.8OD/OD2.0.酶切反应对所选样品采用EcoRI/MseI双酶切：酶切体系(20μL)为:10×酶切缓冲液2μL；EcoRI(10U/μL)0.4μL;MseI(10U/μL)0.4μL;模板DNA200ng；加超纯水至20μL，酶切反应条件为37℃，3h；反应结束后65℃10min使内切酶失活。4.3连接反应接头序列参照附录B。反应体系(20μL)为：10XT4缓冲液2μL;EcoRI接头(50μmol/L)1μL;MseI接头(50μmol/L)1μL;T4DNA连接酶(5U/μL)0.4μL;酶切产物10 μL;加超纯水至20 μL。连接反应条件为：4℃过夜。4.4预扩增反应预扩增引物参照附录B，反应体系为：10X缓冲液2μL;dNTPs(10mmol/L)0.4μL；Taq需(5U/μL)0.2μL；预扩增引物E（20μmol/L)0.5μL;预扩增引物Me(20μmol/L)0.5μL;连接模板2μL;加超纯水至20μL。PCR扩增程序为：94预变性3min;94C变性45s;50℃复性45s，72C延伸1min，26个循环。4.5选择性扩增反应选择性扩增引物参照附录B。反应体系为：10X缓冲液2μL;dNTPs(10mmol/L)0.4μL;Taq酶(5U/μL）0.2μL;选择性扩增引物Epine(20μmol/L)1μL选择性扩增引物M,rin(20μmol/L)1μL;模板DNA2μL(预扩增产物器释20倍）；加超纯水至20μL。PCR扩增程序为：95C预变性5min；95C变性35s，65C复性35s(每循环降低0.7℃C)，72℃延伸1min，12个循环；94C变性30s,56C复性30s，72延伸1min，23个循环，4.6变性将20μL变性缓冲液加人PCR反应产物，95C变性5min4.7制胶和电泳按附录C进行。4.8染色按附录D进行。4.9数据统计作1/0矩阵。2 LY/T 2347—2014附录A(规范性附录)DNA的提取及检测A.1DNA提取A.1.1取0.1g幼嫩