DB37_T 3987-2020兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法.pdf

ICS 65. 020. 01B 16DB37山東东省地方标准DB37/T3987—2020兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Erwinia cypripedii2020-06-08发布2020-07-08实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 3987—2020前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由青岛海关提出、归口并组织实施。本标准起草单位：青岛海关技术中心、厦门海关技术中心、烟台海关技术中心。本标准主要起草人：厉艳、廖富荣、静平、房保海、邵秀玲、封立平、李金庆。I DB37/T 3987—2020兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了兰花细菌性褐腐病菌的分离培养、生理生化特征及分子生物学等检测鉴定方法。本标准适用于兰花植株中兰花细菌性褐腐病菌的检测鉴定及该病害的田间调查与监测。2兰花细菌性褐脑病菌基本信息中文名：兰花细菌性褐腐病菌，构兰欧文氏菌学名: Erwinia cypripedii (hori) Bergey et al. 1923异名: Pectobacterium cypripedii (hori) Brenner et al.1973Pantoea cypripedii英文名： Bacterial soft rot of orchid分类地位：细菌城Bacteria，变形菌门Proteobacteria，-变形菌纲Gammaproteobacteria，肠杆菌目Enterobacteriales，肠杆菌科Enterobacteriaceae，欧文氏菌属Erwinia传播途径：远距离传插主要靠带菌种苗，近距离传插主要借助叶面浇水、喷雾或施肥而将病原菌散播至健康植株上，通过叶片伤口及自然孔口侵染，造成二次感染。3原理根据兰花细菌性褐腐病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检测：根据兰花细菌性褐腐病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定。仪器设备和主要试剂4.1仪器设备及用具PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Bio1og仪、显微镜、高速冷冻离心机、恒温培养箱、超净工作台、高压灭菌器、水浴锅、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量可调加样器、剪刀、解剖刀、玻璃棒、接种环、锻子、培养Ⅲ、酒精灯、三角烧瓶、量筒、离心管、滤纸等。4.2主要试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。商品化试剂参见其使用说明。NA培养基配制方法：蛋白陈10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，调节pH至7.2，用蒸馏水补充至1000mlL，121C高压灭菌15nin。5田间观察检测I DB37/T照附求A中的症状播透观察植株是否有兰花细菌性福膚病的典型症状，对出现典型整状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状植株送实验室进行检测鉴定，田间无症状植株可随机采样。6实验室检测6.1样品制备选择有福腐症状的植株，用脱脂棉葱取75%乙醇擦拭病部表面进行表面消毒，用灭菌剪刀剪取新鲜病叶上的病健交界部位（无症状样品，随机选取叶片）组织置于培养血内，用75%的之醇（或1%的次以酸钠）表面消毒50S60S，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中，加适量无菌水，用灭菌玻裤或募刀势碎组织，静置15min20min后，即制成组织愁浮液，用于分离增养及分子生物学检测。6.2分子生物检测6.2.1模板制备按照6.1的方法制备成样品态浮液后，直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品总DNA，20C保存备用。对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后（97℃沸水浴10min；12000g离心10min，取上清液，-20℃保存）作为分子生物学检测反应模板。6.2.2常规PCR检测对于叶片等植株样品，以已知带菌的兰花植株组织作阳性对照（若无已知带菌材料，可用模拟带菌方式代替），以健康的兰花植株组织作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测。对于纯培养菌株，以E.cypripedi标准菌株作阳性对照，用非Ecypripedi的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附6.3分离培养鉴定按照6.1的方法制备成组织悬浮液后，用灭菌接种环能取悬浮液在NA培养基上划线分离，28℃恒温培养24h后开始观察，挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次～3次，随后进行致病性测定、BIOL0G鉴定、分子生物学鉴定，6.4BIOLOG鉴定利用BI0L0G自动微生物鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定，按照说明书进行操作及结果判定。6.5致病性测定如果有争议或者有必要需按以下步骤对