DB37_T 3127-2018禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 長东省地國方标准DB37/T3127—2018禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范Technical Guideline of Agglutination Test and Indirect ELISA for AntibodyDetection of Bordetellaavium2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3127—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、刘红红、王敏，I DB37/T 3127—2018禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范1范围本规范规定了禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术的术语和定义、试剂或材料、仪器设备，利用平板凝集试验、试管凝集试验和间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测离波氏杆菌抗体的方法和技术要求本规范适用于禽场禽离波氏杆菌的流行病学调查、诊断和疫情监测，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1离波氏杆菌Bordetella avium, B. avium是波氏杆菌属（ThegenusBordetella）四个种中的一个新种，1984年由Kersters确认。3. 2试管凝集试验tube agglutination test常用已知已定量的抗原与一系列移释的离的血清混合，在保温放置后观察结果，以判定受检血清有无相应抗体及其效价，多用于半定量和定量试验，3. 3间接酶联免疫吸附实验indirect enzyme-1inked immunosorbent assay.iELISAELISA是将已知的抗原或抗体吸附在同相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。LISA是基于ELISA反应原理设计的，包被抗原后加入待测抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反应后再洗板，加入底物显色4试剂或材料4.1禽波氏杆菌标准株 DB37/T 3127—2018禽波氏杆菌P5株，购自中国善医药品监察所。4.2禽波氏杆菌阳性血清SPF鸡经免疫禽波氏杆菌抗原三次后获得的血清，每次免疫间隔两周。4.3阴性血清从SPF鸡分离的血清。4.4待检禽血清采集禽的血液，于37℃温箱中静置2h，收集析出的血清。4.5生化试剂灭菌0.5%石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HC1、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制方法见附录A）。5仪器设备5. 1平板（玻板、白瓷板或栽玻片）5. 2微量移液器：量程为20 μL~100 μL。5. 3接种环。5. 4试管架。5. 5小试管（口径8mm~10mm）。5. 6灭菌吸管（1mL）。5. 7恒温培养箱。5. 8匀速振荡器。5.996孔ELISA醇标板。5.10酶标仪（波长范围340nm850nm）。禽波氏杆菌抗体检测平板凝集试验6.1用20叫L微量移液器分别吸取三滴禽波氏杆菌P5株标准抗原于平板上。6.2再分别取禽波氏杆菌阳性抗体、阴性血清和待检禽血清各一滴加入上述抗原液中，并用接种环混合均匀，3min5min观察结果。6. 3平板凝集试验可参考图1：阳性抗原阳性血清阴性血清待检血清2 DB37/T1平板凝集试验图示6.4结果判定：6.4.1阳性血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，朗性血清与阳性抗原作用后仍均匀勾混浊，试验结果有效。6.4.2待检禽血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，则判为阳性。6.4.3待检禽血清与阳性抗原作用后均匀混浊，则判为阴性。6.4.4待检禽血清与阳性抗原作用后介于阴阳性之间，判为可疑。高波氏杆菌抗体检测试管凝集试验7. 1被检禽血清稀释度设定通常情况下，用1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度：大规模检疫时，可只用前两个稀释度。7.2血清的稀释及抗原的加入7. 2. 1血清的稀释7.2.1.1为每份血清准备小试管5支，第一管加入2.3mL石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四、五管各加入0.5mL石炭酸生理盐水，7. 2. 1. 2用1mL吸管吸取被检血清0.2mL，加入第一管中，并混合均匀，然后用吸管吸取混合液0.5mL，加入到第二