SN_T 4179-2015水仙退化病毒检疫鉴定方法.pdf

费记中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4179—2015水仙退化病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Narcissus degeneration virus2015-09-01 实施2015-02-09 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局套真伪 SN/T 4179-2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：林石明、沈建国、廖富荣、方志鹏、吴媛、陈青、陈红运、黄蓬英。I SN/T 4179—2015水仙退化病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了水仙退化病毒血清学、分子生物学检疫鉴定方法。本标准适用于石蒜科等寄主植物中水仙退化病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3水仙退化病毒基本信息中文名称：水仙退化病毒学名:Narcissus degeneration virus缩写：NDV属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyuirus）成员。传播途径：种球传播、机械传播。NDV 的其他信息参见附录 A。4方法原理水仙退化病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。51仪器设备及用具电子天平（1/1000g）、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统、pH计、各种量程的可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μI、20 μL、10 μL、2 μL）、PCR 反应管、无 RNase Eppen-dorf离心管（1.5 mL）、研钵、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、低温冰箱和超低温冰箱等。6 检测与鉴定6.1抽样检查按照SN/T 2122给出的方法进行抽样、取样。6.2捕获抗原酶联免疫吸附测试(PTA-ELISA)按附录B给出的方法进行PTA-ELISA检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。1 SN/T 4179—20156.3RT-PCR 检测按附录 C给出的方法进行RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照,健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。6.4序列测定与分析将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列（或翻译后的氨基酸序列)与已知的NDV相应序列进行比对。注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：///BLAST/。7 结果判定7.1当 PTA-EIISA和 RT-PCR检测结果均为阳性时，则判定为检出水仙退化病毒（NDV）。7.23当RT-PCR检测结果为阳性、测定的序列为 NDV序列时，则判定为检出水仙退化病毒（NDV）。注：根据国际病葬分类委员会（ICTV)第9次分类报告中马铃薯Y病科病毒种类的分类标准，其中关于基因组序列的判定依据为:CP氨基酸序列一致性小于80%，或者 CP基因或整个基因组的核苷酸序列一致性小于76%；并且聚合蛋白的剪切位点不相同。8结果记录记录样品信息及各项检测数据，包括样品来源、种类，检测时间、地点、方法和结果等，以及检测人员签字。血清学检测结果保留吸光值的数据，分子生物学检测结果保留电泳照片及测序峰图等。9样品保存阳性的样品应妥善保存在低温或超低温冰箱中，并做好登记和标识，以备复核。2 SN/T 4179—2015附录A（资料性附录）水仙退化病毒基本信息A.1 寄主范围石蒜科（Amaryllidaceae)的中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）、红口水仙（N.poeticus）、喇叭水仙（N.pseudonarcissus)和石蒜(Lycoris radiata)等。A.2 病害症状在水仙上表现为叶片褪绿条纹、斑驳，花杂色、畸形，以及植株矮化等症状。A.3分布地区主要分布于英国、新西兰、中国等国家。A.4传播途径鳞茎种球等繁殖材料是远距离扩散的主要途径；自然条件下机械传播。A.5粒体形态病毒粒体为线条状，长 750nm～770nm（参见图A.1）。 .图 A.1病毒的粒体（标尺为 200 nm;Chen,et al.,2007)3 SN/T 4179—2015A.6 病毒基因组正义、单链 RNA病毒，基因组全序列大小为 9816个