NYT 1103.2-2006转基因植物及其产品食用安全检测 抗营养素 第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定.pdf

ICS 65.020.99B 04NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1103.2—2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定Safety assessment of genetically modified plant and derived productsPart 2: assay of anti-nutrients pancreatic typsin inhibiter2006-10-01实施2006-07-10 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 1103.2—2006言前本标推由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、农业部科技发展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。本标准主要起草人：杨月欣、王竹、韩军花、李宁、汪其怀、黄昆仑、刘克明、刘培磊、连庆。F- NY/T 1103.2--2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定1范围本标规定了转基因植物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定方法。本标准适用于转基因大豆及其产品、转基因谷物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定。其他的转基因植物,如花生、马铃薯等也可用该方法进行测定。2　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1转基因植物 genetically modified plant指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的植物。2.2转基因植物产品 products derived from genetically modified plant指转基因植物的直接加工产品和含有转基因植物的产品。3原理胰蛋白酶可作用于苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPA),释放出黄色的对硝基苯胺,该物质在410 nm下有最大吸收值。转基因植物及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应,使吸光度值下降,其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。用分光光度计在 410 nm 处测定吸光度值的变化,可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。4试验材料转基因植物及其产品、受体植物及其产品。如果对转基因植物产品中的胰蛋白酶抑制剂进行测定，转基因植物产品和受体植物产品的处理条件应相同。上述材料的水分含量和种植环境应基本一致。5 试剂除非另有说明，仅使用分析纯试剂；水为蒸馏水。5.1 三羟甲基氨基甲烷[ tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]。5.20.05 mol/L Tris 缓冲液:称取 6.05g Tris 和2.94g 氯化钙(CaCl2°2H,O)溶于 800 mL水中,用浓盐酸调节溶液的 pH 至 8.2,加水定容至 1 L。5.30.01mol/L氢氧化钠溶液：称取0.4g氢氧化钠,加人800mL水溶解后,再加水定容至1L。5.4 成烷:已烷(1:1,V:V)。5.5 1 mmol/L盐酸。5.6胰蛋白酶:大于10 000 BAEEμ/mg。BAEE 为 Nα-苯甲酰-L-精氨酸乙烷酯(Nα-benzoyl-L-arginine ethyl ester)。BAEE u(BAEE 单位)表1 NY/T 1103.2--2006示胰蛋白酶与BAEE在25℃、pH7.6、体积3.2mL条件下反应,在253nm波长下每分钟引起吸光度值升高 0.001,即为 1 个BAEE u。5.7 胰蛋白酶溶液:称取 10 mg 胰蛋白酶,溶于 200 mL 1 mmol/L盐酸中。5.8 苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺(benzoyl-DL-arginine p-nitroanilide, BAPA)。5.9 BAPA底物溶液:称取 40 mg BAPA,溶于1 mL,二甲基亚砜中,用预热至 37℃的 Tris缓冲液稀释至 100 mL。BAPA 底物溶液应于实验当日配制。5.10反应终止液:取 30 mL冰乙酸,加水定容至 100 mL。6仪器和设备6.1通常实验室仪器设备。6.2 恒温水浴箱。6.3分光光度计。6.4旋涡搅拌器。6.5电磁搅拌器。7操作步骤7.1试样的制备将试验材料磨碎,过筛(筛盘为 100 目～200 目)。称取 0.2g～1 g试样,加人 50 mL 0.01 mol/L氢氧化钠溶液,pH应控制在8.4～10.0之间,低档速电磁搅拌下浸提3h,过滤。浸出液用于测定，必要时，可进行稀释。如果试样的脂肪含量较高(如全脂大豆粗粉或豆粉),应在室温条件下先用成烷：已烷(1:1)脱脂。脱脂方法如下：将试样浸泡于20mL戍烷：已烷(1:1)中，低档速电磁搅拌30min，过滤。残渣用约50mL戌烷:已烷(1:1)淋洗两次,收集残渣。然后进行浸提。7.2测定管和对照管的制备取两组平行