YY_T 1562-2017组织工程医疗器械产品生物材料支架细胞活性试验指南.pdf

C 45ICS 11.040.40YY中华人民共和国医药行业标准YY/T1562—2017组织工程医疗器械产品生物材料支架细胞活性试验指南Tissue engineering medical device products-Biomaterial scaffolds-Guide for cell viability evaluation2017-03-28发布2018-04-01实施国家食品药品监督管理总局发布 YY/T 1562—2017前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准出国家食品药品监督管理总局提出。本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会(SAC/TC 110/SC 3)归口,本标准起草单位：中国人民解放车第四车医大学、中国食品药品检定研究院，本标准主要起草人：金岩、张勇杰、徐丽明、罗海浪、邵安良、方玉、付海洋。 YY/T 1562—2017也可使用。一些生物材料(特别是软的生物材料)可以制备切片后用酶标仪计数定量。也可以采用商业化的荧光抗体标记有增殖活性的细胞或无活性细胞，然后采用流式细胞仪计数和分类。有的细胞通过基因修饰后会自发荧光，这种情况下成该采用二维培养和限定数量的细胸来计算特异性荧光值。6.4.5共聚焦显微镜在用荧光标志物标记活性细胞或无活性细胞后，共聚焦显微镜能用来区分构建物内活性细胞和无活性细胞的分布。因为其聚焦显微镜速常最大只能穿舜透几百激米，因此有必要使用多个切片来定量构建物内活性细胞的比例和分布，双光子共聚焦显微镜或像利用细胞的自发荧光对三维文架中的细胞活力进行分析，这种方法无需对细胞进行染色或将细胞和材料分离，但细胞类型决定的细胞自发荧光的光谱和强度决定了成像的效果。共案焦品微镜的应用在一定释度上受到样本厚度的限制，面多光于成像技术能在一定程度上避免这个间题。根据切片的厚度，无共聚焦功能的显微镜也可以被用于定量活细胞数目，据供构建物内部的三维细胞样体的信息，6.4.6扫描电于显微镜(E-SEM)进行分析。细胞固定需用传统电子显微镜的组织固定和脱水方法进行，E-SEM需要进行的试验准备较少[例如，观察前用钾次钟股盐级冲渡配置的2.5%(体积分数)二整处理1h]，冷冻扫描电子显微镜(Cryo-SEM)不需要固定样品。样品冻T后直接转移到小室分析。通常，样品中间及外表面都需要分析，6.4.7磁共报成像对于非常厚的生物财料支架（毫术级到厘术级)，可以使用氧化铁或乱造影的高避场磁共握成像。这种方法的应用受到分辨率和对比度的较大制约。6.4.8Miero-CTMirco-CT具有较高的分辨率，可对体外及活体内的组织工程构建物进行定量或空间分布的检测，检测前一般需用四氧化镜对细脑进行标记，增加细胞的显影。6.4.9成像分析概述除了使用成像分析软件来定量荧光标记的细胞数目，还可以完成其他一些更复杂的分析，例如，分析细胞密度，细胞伸展以及活性细胞和无活性细腹的空闻均一性。细胞密度分析应在分析前对细胞进行染色，通常采用细胞核料，如4，6-二脉基-2-苯基吲哚(DAPI)，来确定细胞位置，可以沿着构建物横截南采集连续深度的多色图像，需生意通免支架材料在制片过程中酸碍、如果定量大多数长在生物材料支架外部的细胞，可能比定量均匀分布在表面的细胞更为围难。细胞聚团可能会影响计算的精确性，如果编胞在生物材料支架表面或内部成或聚集，细胞数目的统计可能不准确，例如，胰岛或神经球中一群细脂可以含有成千上万个细脂紧密包塞在一起。8 YY/T 1562—20细胞伸展分析应在分析前对细胞进行染色[例如，得克萨斯红-C2-马来酰亚胺可以染整个细胞，而46-二咪基-2-举基吲噪(DAPID)可以染细胆核]，细胞密度和伸展可以通过测量在特定区域内目标细胞的面积、阻度、长宽比和周长来定量。尽管这些染料非常适用二维培养的细胞，但在三维生物材料文架上的染料残留能够显著增加背景值，从而降低细胞边缘的对比度，所以非细胞区域的染料可以通过充分的洗涤来去除。空间分布均匀度检剩除了检测细胞密度，也可以统计测量特定生物材料文架内部细脑的空间分布均匀度。这种方法涉及利用图像分析程序统计分析细胞位置（几何参数)来计算变异系数， YY/T献[1] GB/T 14233.2医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法[2] GB/T 16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验[3] GB/T 16886.5医疗器板生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验[4]中华人民共和国药典第三部(2015年版）[5]ASTM F273908:Standard guide for q