WST 42-1996血中碳氧血红蛋白的分光光度测定方法.pdf

中华人民共和国卫生行业标准血中碳氧血红蛋白的分光光度WS/T 42-1996方法测定Blood-Determination of carboxyhemoglobin-Spectrophotometric method一1主题内容与适用范围本标准规定了血中的碳氧血红蛋白的分光光度测定方法。本法最低检测浓度为2%HbCO。本标准适用于正常人和接触一氧化碳工人血中HbCO浓度的测定。2原理血液中含有四种血红蛋白成分，即还原血红蛋白（Hb）、氧合血红蛋白（HbO2）、碳氧血红蛋白（HbCO）及微量的变性血红蛋白（MetHb），用连二亚硫酸钠将HbO2和MetHb还原成Hb，则血液中只存在HbCO（1）和Hb（I）两种成分。I的最大吸收波长在420nm，Ⅱ的最大吸收波长在430nm。测出被检血样在两个波长的吸光度，再利用I与I在两个波长下的摩尔吸光系数计算HbCO的百分浓度。3仪器3.1分光光度计，10mm比色杯。3.2液体快速混合器。3.3采血吸管。3.4小玻璃管，25mm×4mm，带帽。3.5试管，10mL，具磨口塞，实际能盛15mL至满。4试剂本标准所用试剂除另有说明者外，均为分析纯试剂。4.1实验用水：去离子水或经全玻璃蒸馏器重蒸的水。4.2 硫酸,P20=1.84g/mL。4.3甲酸，85%（m/m）。4.4连二亚硫酸钠（Na2S2O4）。4.5氮气，高纯。4.6氧气，高纯。4.7一氧化碳纯气，钢瓶装或自制。制备方法：在装有滴液漏斗和气体导出管的烧瓶中加入甲酸（4.3），自滴液漏斗滴加浓硫酸，产生的一氧化碳通过内装氢氧化钠水溶液（4.8)的洗气瓶及缓冲瓶后通入样品液中。操作应在良好的通风橱内进行。4.8氢氧化钠溶液，20g/L。1997-05-01实施中华人民共和国卫生部1996-10-14批准 WS/T 42-19964.9血液稀释液,0.02mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)溶液。4.10肝素溶液，5g/L。5采样、运输和保存取末梢血约10uL，直接注入到小玻璃瓶中（事先加入5g/L肝素溶液40uL），立即加帽，旋转混匀以防凝血。于保温瓶中加冰运送，置冰箱冰盒内（一8C）保存。一周内分析完毕。6分析步骤6.1摩尔吸光系数的测定摩尔吸光系数不易测定。但在本法计算中，可用同一浓度的血样制得Hb及HbCO，测其在420nm，430nm下的吸光值来代替，作为常数。测定方法如下：取不吸烟健康人血（肝素抗凝）用水稀释5倍。取0.3ml.加Tris稀释液（4.9）至90mL通氧气30min。从中取4份，每份15mL于具塞试管中。其中两份通氮气10min以除去过剩的氧，得到HbO液。另两份通纯一氧化碳气10min，得到HbCO液。立即将HbOz、HbCO制备液分别转入内盛60mg连二亚硫酸钠的具塞试管中，混匀，放置10min测量。读取430nm和420nm的吸光度值，代替摩尔吸光系数（以下简称吸光常数）。6.2样品处理和测定将冷藏的血样于室温放置，用液体混合器混匀。迅速取10μL（二个平行样），加入内盛15mLTris溶液（4.9)的具塞试管中（若采样后随即分析，可直接取血10μL放入内盛15mLTris溶液的试管中），加入60mg连二亚硫酸钠，轻轻混匀放置10min，用10mm比色杯以试剂空白为参比，测其在420nm和430nm处的吸光度值。7 计算按下式计算血中HbCO的浓度。A430 · k2 - A420 · kX = Ao(k= k,) - Amn(k, - k)式中X血中碳氧血红蛋白的浓度，%；A20—血样在420nm的吸光度读数；A43——血样在430nm的吸光度读数；k,-—HbCO在420nm的吸光常数(6.1);k2 ]HbCO在430nm的吸光常数（6.1）；k:——-Hb在420nm的吸光常数（6.1）；k，——Hb在130nm的吸光常数（6.1)。8说明8.1本法检测限（0.02吸光度对应的浓度）为2%HbCO。测定范围：2%～70.5%HbCO。精密度：批间变异系数为1.9%～5.6%（HbCO浓度为9.9%、36.6%、56.8%，n=6）。准确度：中毒病人血样加已知HbC0）浓度血测定回收率，平均为95.8%（三个浓度，n=8）。8.2本法测定所依据的Hb与HbCO含量比例与血红蛋白含量高低无关，因此取血量不需要很准确。吸光度常数测定后只要仪器波长稳定，可较长时间使用。8.3空气中有大量氧气，所以血样及制成的待测液接触空气越少越好。实验证明含HbCO20%及近饱和HbCO的待测液，其容器上端空气分别为5～6mL及20mL时，较装满或近满者，测定结果HbCO平均下降4.5%及10.2%（n=6）。 WS/T 42-19968.4非高纯级的钢瓶氧气和氮气含有微量的一氧化碳。制备Hb0)时应通过加热至80～