SN_T 1224-2012禽支原体病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1224--2012代替SN/T1224—2003禽支原体病检疫技术规范Quarantine protocol for avain mycoplasmosis2012-12-12发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局力 SN/T1224—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准与 OIE《Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals》（2010 版)第2.3.5节《禽支原体病诊断标准》的一致性为非等效。本标准代替SN/T1224---2003《鸡败血支原体感染抗体检测方法快速血清凝集试验》。本标准与SN/T1224一2003相比，主要技术变化如下：一增补了该病的临床病理诊断内容；在实验室诊断方法上增加了病原分离及间接免疫荧光（IFA）、PCR鉴定方法，免疫胶体金快速检测、血凝抑制试验和酶联免疫吸附试验方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、华中农业大学、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈建军、肖运才、李东、冯汉利、叶奕优、曾宪东、杨武、毕丁仁、郭明星。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1224—2003。- SN/T1224—2012禽支原体病检疫技术规范1范围本标准规定了禽支原体病的临床诊断、血清学诊断及禽败血支原体（MG)分离培养和鉴定方法。本标准适用于禽支原体病的检疫诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。AM：禽支原体病（avainmycoplasmosis）CRD：慢性呼吸道疾病（chronicrespiratorydisease)MG：禽败血支原体（禽败血霉形体）（mycoplasmagallisepticum）MS：滑液支原体（mycoplasma synoviae)4疫病概述禽感染各类致病性支原体引起的疾病都统称为禽支原体病（AM），其中由MG感染所致的AM最为常见，又称鸡慢性呼吸道病（CRD)，其病原学、流行病学、临床症状及病理变化参见附录A。5实验室诊断5.1MG的分离培养5.1.1材料准备检验设备、器材：生物显微镜、人射式荧光显微镜、二氧化碳培养箱、灭菌棉拭子、载玻片、pH精密试纸。试剂：MG液体培养基、MG固体培养基、磷酸缓冲液（0.01mol/L，pH7.2PBS)（见附录B）。5.1.2病料的采取和保存病料从活禽及新鲜的死禽中采集，对于活禽，可从鼻腔、口咽部、眼部、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气囊采样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。小块组织置于MG液体培养基中，拭子在培养基中用力搅拌数次，样品尽快培养。所有实验操作应符合中GB19489实验室生物安全通用要求的规定。1 SN/T 1224--20125.1.3分离培养将样品0.2mL接种于1.8mLMG液体培养基中，依次10倍稀释至10*3，密封.37℃培养。同时将样品接种于MG固体培养基中，置于含5%～10%二氧化碳培养箱中培养。每天检查液体培养基酸碱度，-~旦发现pH值变化，立即接种于MG固体培养基中培养。若培养基酸碱度没有变化，每隔3d～5d盲传一代，共传3代，培养10d后接种于MG固体培养基上培养。MG固体培养基上若有菌落生长，用低倍显微镜观察，可见中央突起呈荷包蛋样典型菌落（参见附录C.1)，可初步判断为MG，菌落形态不典型时，需进一步作血清学、分子生物学鉴定。5.1.4纯化..3将液体培养物稀释至10-体培养基待典型菌落长成时，挑取单个菌落接 2s3种MG液体培养基，重复三次培克泽5.1.5生化特征MG和MS可发酵葡萄糖，但不能5.2病原鉴定5.2.1间接免疫荧光抗体试验取1.0cm～1.5cm的琼脂块，菌落面朝上置于载玻片上，第一块载玻片上放一块待检分离物、一块已知MG菌落（S6或R株）快已知其他原体菌落第二块载玻片上放一块待检分离物。第一块载玻片上每块璃瞻换稀N择的免抗MG血清，第二块载玻片上琼脂块上上加一AN加一滴正常兔血清。后，分别放到会有pH7.2PBS磷酸盐缓冲液的不间琼脂块在湿盒中室报应3.0器皿中，冲洗10min，冲洗2水纸吸取过将琼脂块放回原玻的水分，每块琼脂加上稀释好的抗免荧光抗体结合.吸干多余物，反应、洗涤同