SN_T 1632.2-2013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法 第2部分：PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1632.2--2013代替 SN/T 1632.2--2005出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法　第 2 部分:PCR方法Determinetion of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp. )from dehydratedpowdered milk for export-Part 2 :PCR method2014-06-01实施2013-11-06 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1632.2---2013前言SN/T1632《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法》共分为3个部分：一第1部分：分离与计数；-第 2 部分:PCR方法;—第 3部分:荧光 PCR方法。本部分为SN/T1632的第2部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分代替SN/T1632.2-2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分：PCR检验方法》。本部分与SN/T1632.2--2005相比，主要技术变化如下：本标准按照GB/T1.1一2009规范了文本格式；修改了标准的中英文名称;一删除了定义、术语和缩略语;删除了分离培养基结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院，本部分主要起草人：张霞、刘培、赵贵明、高旗利、吴冬雪、张海英、曲鹏、赵良娟、张宏伟。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1632.2--2005。I SN/T 1632.2—2013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第 2 部分:PCR 方法范围SN/T1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）的PCR检测方法。本部分适用于奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属寸的快速定性检测，其他食品可参照执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403—2008　实验室质量控制规范　食品分了生物学检测SN/T1632.1奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）第1部分：分离与计数方法3设备和材料3. 1天平：量程2 kg，感量0.1 g。3.2水浴箱：保持水温44.5℃±0.23.3培养箱：35℃～37℃和43℃45℃3.4PCR 仪。3.5离心机。3.6紫外凝胶成像仪。3.7电泳仪。3.8pH计。3.9移液器:2 μL～10 μL、10 μL～100l20 t1.~200 μL、100 μL1 000 μI。4培养基和试剂实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规定。4.1改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（mLST-Vm)（见附录 A 中 A.1）。4.2脑心浸液(BHI)（见 A.2)。4.3营养肉汤（NB)（见 A.3）。4.4引物 SAKAF :5′-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3’;SAKAR:5GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3’4.5Taq DNA 聚合酶。4.6dNTP:dATP、dTTP,dCTP、dGTP。4.710XPCR 缓冲液。4.8阪崎肠杆菌质控菌株：ATCC29544，或等效菌株。4.9DNA 提取试剂:细菌基因组 DNA 提取试剂盒。1 SN/T 1632.2—20134.10 TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1 mmol/1. EDTA(pH8.0)。4.11琼脂糖：分析纯。4.12GelRed 或 GelGreen 核酸染色剂。4.13分子量标记:100 bpDNA ladder。4.14 5× TBE 电泳缓冲液:Tris 54 g、硼酸 27.5 g、0.5 mol/L EDTA（pH8.0)20 mL.加蒸馏水至1 000 mL,使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。4.156×加样缓冲液。4.16克罗诺杆菌显色培养基（见A.4）。5阪崎肠杆菌检验方法5.1方法提要奶粉经增菌后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否有特征条带，从而对奶粉中是否污染阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属)进行快速检测。5.2检验程序见图1。样品100g加到900mLmLST-Vm中44℃22 h~24 h0.2mL mLST-Vm增菌液加到5 mL BHI中36℃±1℃↓水浴4hP