SN_T 4292-2015家蚕微粒子病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4292—2015家蚕微粒子病检疫技术规范Quarantine protocol for pebrine2015-09-02发布2016-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局OEA0OR副涂脑造真伪 SN/T 4292—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：何永强、吴姗、曹琛福、鲁兴萌、黎昊雁、帅江冰、张晓峰、朱振江、戴云通、王素华-李晓军。1 SN/T4292-2015家蚕微粒子病检疫技术规范1范围本标准规定了家蚕微孢子虫的实验室检测，包括光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应（PCR）法和实时荧光PCR法。本标准适用于进出境家蚕微粒子病的检疫2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1家蚕silkworm(Bombyxmori)）家蚕为完全变态昆虫，具有卵、幼虫、茧和蛾（成虫）四个虫态3.2蚕卵（蚕种）silkwormegg蚕卵外观略呈扁平椭圆形，一端稍尖为前端，另一端稍钝为后端，膨起的一方为腹侧，与腹侧相对的一方为背侧。蚕种是指用于养蚕生产和商业的蚕卵3.3蚕幼虫silkworm larva(larvae)从卵孵化后的蚁蚕到化蛹期间的蚕，蚕幼虫呈长圆简形，背方为圆形，分头部、胸部和腹部3个明显的体段。3.4蚕茧silkwormcocoon蚕从吐丝器吐出丝物质后形成的，呈椭圆形和球形等形状，外为丝物质内存蚕蛹的蚕阶段。蚕茧分为干茧（driedcocoon）和鲜董（freshcocoon）。前者是经过60℃～12o℃干燥处理6h，充分干燥的蚕茧，后者是未经高温干燥处理的活蛹蚕茧。3.5蚕蛾silkwormmoth分头胸腹3个体段，中后胸各有一对翅，全身被白色鳞片。3.6蚕微孢子虫nosemabombycis;Nb属原生动物界微孢子虫门，微孢子虫目，微孢子虫属，呈椭圆形，大小约为（3um～4um）×（1.5um～1 SN/T 4292-20152um），是蚕微粒子病的病原体。3.7产附 aspect of laid eggs家蚕母蛾将蚕卵产于蚕连纸或夏布上的附着情况。4临床病症4.1蚕幼虫的病症体色不正常，呈锈色，大小不均勾，发育迟缓，举动不活泼。小蚕期表现为收蚁后不疏毛，体色深暗，体躯瘦小，易发生“细蚕”；蚕儿稍大后出现焦尾蚕、焦足蚕和半脱皮蚕、不脱皮蚕，蚕体小，皮肤多皱褶。4.22蛹体病症出现大肚蛹，腹部环节松弛，环节上有大小不等的病斑，体表无光泽，反应迟钝。4.33蛾体病症出现卷翅蛾，羽化后长期不展翅，或展翅不全；蛾体腹部有大小不等黑斑的黑星蛾；蛾体鳞毛脱落?呈焦黄色的秃蛾；蛾体腹部节间伸长松弛的大肚蛾，翅短小，病蛾交配能力差，产卵少，产附不整齐。4.4蚕卵病症卵形不正，大小不均勾，排列不整齐，产重叠卵，易脱落，不受精卵、死卵多。55实验室诊断5.1光学相差显微镜检查法5.1.1材料和设备盖玻片。拭子。剪刀。镊子。PR(）250捣碎机或其他等效设备。纱网：50目～100目。离心管(1.5mL、5ml、15mL)。光学相差显微镜（600倍或400倍）。5.1.2样品待检液制备采取家蚕的卵（或幼虫、茧、母蛾等）样品，按照1：10加人生理盐水，用PRO250等捣碎机充分捣碎（经过干燥处理或放置时间较久的样本，则需漫泡12h后再捣碎；鲜活5龄幼虫需解剖取中肠，用中肠捣碎），勾浆液用纱网（规格50目～100目）过滤，收集滤液。滤液差速离心（500r/min，离心1min弃沉淀，然后上清液以5000r/min，10min离心，弃上清液）2次～3次。用适量（约样本质量体积比的1倍～10倍生理盐水悬浮，作为微孢子虫待检液，立刻使用或一20℃冰箱保存。2 SN/T 4292—20155.1.3操作步骤从5.1.2制备的每个离心管中取出2个待检液样本50uL，滴于载玻片，盖上盖玻片，用40×15（或10)倍光学相差显微镜2人对检，先看中间，边调节微调旋钮，边慢慢移向四周，保证每个标本不少于20个视野。5.1.4结果判定光学相差显微镜检出家蚕微孢子虫者（参见附录A)为阳性，未检出家蚕微孢子虫者为阴性。5.2聚合酶链式反应（PCR)和实时荧光PCR方法5.2.1试剂与材料试剂与材料包括：蛋白酶K、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇、2mg/LRNAaseATaqDNA