SN_T 4076-2014百合无症病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4076—2014百合无症病毒检疫鉴定方法Detection and identification of lily symptomless virus2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4076---2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：廖富荣、沈建国、方志鹏、林石明、吴媛、陈青、陈红运、黄蓬英。I SN/T 4076—2014百合无症病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了百合无症病毒免疫学、分子生物学检疫鉴定方法。本标准适用于百合属、印加百合属、郁金香属、水鬼蕉属等寄主植物的鳞球茎、叶片中百合无症病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2119　进境观赏鳞球茎检疫操作规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3 百合无症病毒英文名称：lily symptomless virus缩写:LSV同种异名:lily streak virus、lily symptomless carlavirus、lily curl stripe virus、Alstroemeria carla-virus, Alstroemeria latent virus, lily virus.分类地位：芜菁黄花叶病毒目（Tymovirales）、β线状病毒科（Betaflexiviridae）、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。传播途径：经蚜虫非持久性传播、机械传播和种球传播。LSV的其他信息参见附录A。４　方法原理百合无症病毒(LSV)的免疫学、分子生物学特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。5 主要仪器设备及用具植物汁液提取仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2 μL)。6　主要试剂血清学试剂见附录 B、分子生物学试剂见附录 C和附录 D。1 SN/T 4076--20147 检测与鉴定7.1抽样检查按照SN/T2119、SN/T2122给出的方法进行抽样、取样。7.2血清学检测(DAS-ELISA方法）按附录B给出的方法进行检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。7.3分子生物学检测7.3.1 RT-PCR 检测按附录 C给出的方法，提取样品总RNA，进行RT-PCR检测。用 LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，并设置空白对照。7.3.2实时荧光 RT-PCR检测按附录D给出的方法，提取样品总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测。用 LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，并设置空白对照。7.3.3序列测定与分析将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列与已知的LSV相应序列进行比对，如果与已知的LSV相应序列具有高度同源性，则判定为 LSV序列，否则为非 LSV 序列。注1：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：///BLAST/注2:国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)关于香石竹潜隐病毒属（Carlavirus)种类区分标准之一：外壳蛋白或聚合酶基因核苷酸序列同源性低于72%（或氨基酸低于80%）。8结果判定8.1采用DAS-ELISA进行初筛检测，当检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒（LSV）。8.2采用DAS-ELISA进行初筛检测，当检测结果为阳性时，用分子生物学方法进行验证：当RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒(LSV);一-当RT-PCR或实时荧光 RT-PCR方法检测结果为阳性时，则判定检出百合无症病毒（LSV）。8.3采用RT-PCR方法进行初筛检测，当检测结果为阳性时，则进行序列测定分析：—当测定的序列为 LSV 序列时,则判定检出百合无症病毒(LSV);一当测定的序列非 LSV 序列时,则判定未检出百合无症病毒(L