SN 1666-2005水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1666-2005水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法普通 RT-PCR 方法和实时荧光 RT-PCR 方法Detection of rice stripe virus, rice dwarfvirus andrice black streaked dwarfvirus-Conventional RT-PCR and real-time fluoescence RT-PCR2005-09-30 发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1666—2005前 言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：朱金国、陈红运、朱水芳、李献坤、黄志强、陈白藉、姜金林、向俨。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。- SN/T 1666—2005水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法普通 RT-PCR 方法和实时荧光 RT-PCR方法1范围本标准规定了水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的普通 RT-PCR 和实时荧光RT-PCR 检测方法。本标准适用于水稻、玉米和媒介昆虫中的水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文伴，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1水稻条纹病毒rice stripe virus,RSV属纤细病毒属(Tenuiuirus)病毒,病毒粒子为分枝线状，含单一的核衣壳蛋白，病毒基因组由四个单链正义RNA和四个双链RNA组成。在自然界中由飞灰虱传播，主要侵染未本科植物。侵染水稻可引起褪绿黄斑、黄绿色条带、枯萎、抽穗畸形等症状。3.2水稻矮缩病毒rice dwarf virus,RDV属呼肠孤病毒科植物呼肠病毒属（Phytorevirus)病毒，病毒粒子为具有双层外壳蛋白二十面体双链RNA病毒，在自然界中由叶蝉传播，主要侵染禾本科植物。侵染水稻可引起矮缩、扭曲、色斑生长受阻等病理状态。3.3水稻黑条矮缩病毒rice black streaked dwarf Virus,RBSDV属呼肠孤病毒科斐济病毒属（Fijiirus)病毒，具有双层外壳蛋白双链 RNA病毒。在自然界中由飞虱科昆虫传播，主要侵染禾本科植物。侵染水稻可引起植株矮化、韧皮部细胞增生和出现隆起、变色斑块等病理症状。3. 4聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR聚合酶链式反应，简称PCR技术。模板DNA先经高温变性为单链，两条引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火,在 DNA 聚合酶的催化下以四种 dNTP 为底物,使退火引物得以延伸,如此反复变性、退火和 DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。1 SN/T 1666—20053.5逆转录-聚合酶链式反应 reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR逆转录-聚合酶链式反应，简称 RT-PCR，以提取组织或其他材料中的 RNA为模板，采用 Oligo（dT)或随机引物，在逆转录酶和适宜的反应条件下,RNA被逆转录成cDNA,然后再以 cDNA作为模板，进行 PCR扩增。3.6实时荧光 PCR real-time fluoescence PCR,RTF-PCR实时荧光 PCR方法是在常规 PCR的基础上，在引物对所扩增序列段中,加人一条特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Tag酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子游离产生荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。4检测方法4.1方法原理水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒都是RNA病毒。如果样品材料中提取的总RNA 中含有水稻病毒的 RNA,可通过逆转录酶将病毒 RNA 逆转录成 cDNA,再通过根据病毒核酸保守序列设计的引物对 cDNA进行 PCR扩增。分析 PCR结果即可明确材料中是否含有病毒核酸成分。采用