SN_T 4661-2016施马伦贝格病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4661—2016施马伦贝格病检疫技术规范Quarantine protocol for Schmallenberg disease2016-12-12 发布2017-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局W#1e7698刮涂层查真 SN/T 4661—2016前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国河北出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张永宁、吴绍强、林祥梅、王娜、吕继洲、冯春燕、邓俊花、王建昌、胡传伟。 SN/T 4661—2016施马伦贝格病检疫技术规范1‧范围本标准规定了施马伦贝格病实时荧光反转录-聚合酶链式反应和阻断酶联免疫吸附试验的技术规范。本标准适用于施马伦贝格病的检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样GB19489　实验室　生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。SBV:施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus)RNA:核糖核酸(Ribonucleic acid)rRT-PCR:实时荧光反转录-聚合酶链式反应(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction)Ct 值:循环阈值(Cycle threshold)ELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay)McAb:单克隆抗体(Monoclonal antibody)TBST:含 0.05%吐温-20 Tris-盐酸缓冲液(Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20)OD值:光密度值(Optical density value)PI :阻断率(Percentage of inhibition)4施马伦贝格病概述施马伦贝格病概述参见附录 A。实时荧光反转录-聚合酶链式反应(rRT-PCR)5‘5.1主要试剂与材料5.1.1 TRIzol 试剂。5.1.2无RNA酶水。SBV RNA 阴性对照、SBV RNA 阳性对照：由标准起草单位提供含 SBV N 基因的假病毒。5.1.31 SN/T 466120165.1.4 rRT-PCR 通用试剂:AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit’。5.1.5 引物:上游引物(5-3）:TCA GAT TGT CAT GCC CCT TGC,下游引物(5′-3):TTC GGCCCC AGG TGC AAA TC.5.1.6 TaqMan 探针(5-3):FAM-TTA AGG GAT GCA CCT GGG CCG ATG GT-BHQ1。5.1.7 PCR 反应管。5.2主要仪器设备5.2.1生物安全柜。5.2.2荧光PCR仪。5.2.3-70℃冰箱、20℃冰箱、4℃冰箱。5.2.4高速冷冻离心机。5.2.5组织研磨器。5.2.6高压蒸汽灭菌器。5.2.7可调式微量移液器（0.5 μL～10 μL、10 μL～100 μL、100 μL～1000 μL)。5.3 样品的采集按照GB/T18088有关规定进行采样。疑似感染活动物可无菌采集EDTA抗凝血或不加抗凝剂的血液(分离血清用）；对于产死胎或畸形胎的母畜可无菌采集羊水和胎盘；对于死胎或畸形胎可无菌采集脑组织（主要为大脑和脑干）、心包液、羊水、吸初乳前的胎儿血液和胎粪。采样完毕后，应按规定填写“送样单”,2℃～8℃运送至实验室进行检测。采样人员应严格按照GB19489做好生物安全防护。5.4样品的处理5.4.1血液：采集EDTA抗凝血，置4℃冰箱保存备用；若24h内不检测，应置一70℃保存。5.4.2血清：将采集的无抗凝剂血液呈45°～60°角于室温静置1h、4℃冰箱静置1h，3000r/min离心5 min，收集上清液，置一20℃保存备用。5.4.3精液：将新采集的反鱼动物精液用灭菌生理盐水做4倍稀释，商品化的反台动物精液不用稀释，置一70℃保存备用。5.4.4脑组织、胎粪：将采集的脑组织或胎粪样品置研钵内，加人5倍样品体积的含2%胎牛血清DMEM进行研磨，置一20℃冰箱冻融2次，3000r/min离心5min，收集上清液，置一20℃保存备用。5.4.5羊水、心包液：将采集的羊水或心包液，3000r/min离心5min，收集上清液，置一20℃保存备用。5.5SBV RNA 提取5.