SN_T 3639-2013出口食品中空肠弯曲菌的检测方法 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3639—2013出口食品中空肠弯曲菌的检测方法实时荧光PCR法Determination of Campylobacter jejuni in food for export-Real-time PCR method2013-08-30 发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3639—2013前言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国广西出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、上海辉睿生物技术有限公司。本标准主要起草人：蒋原、祝长青、王毅谦、张睿、唐泰山、邵景东、沈涛、石建华、栾军、郭云昌、朱金国、王振国、薛峰、陈国强、郑文杰、陈广全、刘军义、李寿崧、刘秀梅、黄晓蓉、雷质文、李辉。I SN/T 3639--2013出口食品中空肠弯曲菌的检测方法实时荧光 PCR 法1范围本标准规定了食品中空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的实时荧光PCR方法。本标准适用于食品中空肠弯曲菌的基因检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.9　食品卫生微生物学检验　空肠弯曲菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室　生物安全通用要求SN/T 0175　进出口食品中弯曲菌的检测方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求3防污染措施检验过程的防污染措施应符合 SN/T1193。4实验方法4.1设备与材料4.1.1实时荧光PCR仪。4.1.2超净工作台。4.1.3消毒灭菌锅。4.1.4制冰机。4.1.55核酸蛋白分析仪。4.1.65高速冷冻离心机：转速≥8 000r/min;台式小型离心机：转速≥13000 r/min。4.1.7低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。4.1.8纯水器，双蒸水器。4.1.9旋涡振荡器。4.1.10微量移液器。4.1.11无 Dnase/Rnase 的光学 PCR反应管或板。4.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。V SN/T 3639—20134.2.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。4.2.2PCR缓冲液。4.2.3 MgCl2 .4.2.4 dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)。4.2.5 Taq 酶。4.2.6 引物:上游引物:5-AAATAGGACTTCGTGCAGATATGG-3下游引物 5-ACAATCCATCTTCTATCATTGCCT-3”4.2.7探针：（荧光报告基团）-5-AGCACCACCCAAACCCTCTTCAGC-3′-（荧光淬灭基团）。4.2.8 DNA 提取液:50 mmol/L Tris. HCl(pH 8.0),100 mmol/L EDTA(pH 8.0),100 mmol/LNaCI, 1 % SDS.4.2.9 TE溶液(pH 8.0):10 mmol/I, Tris. HCl(pH 8.0),1 mmol/1 EDTA(pH 8.0),高压灭菌。4.2.10酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25/24/1)。4.2.11 异丙醇。4.2.12 75%乙醇。5检测步骤5.1样品处理、增菌和分离样品处理、增菌与分离步骤参照GB/T4789.9或SN/T0175进行。5.2模板DNA的制备5.2.1增菌液模板DNA的制备取待测样本1mL,加到1.5ml.离心管中，8000r/min离心3min，尽量弃去上清液。加人750μlDNA提取液，65℃温浴30min,加酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)500μl，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取500μl.上清液与400 μl的异丙醇充分混合;13000r/min离心5min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13000 r/min离心5／min,弃去上清，沉淀干燥后溶于30 μl.TE溶液中，立即用于检测或短期保存于一20℃。注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。5.2.2纯菌落模板 DNA 的制备用一次性器具从分离平板上挑取5个菌落，转人盛有30μl灭菌超纯水的离心管中，煮沸5min,转人冰水浴中5 min，13