SN_T 3739-2013国境口岸森林脑炎病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3739--2013国境口岸森林脑炎病毒检测方法实时荧光 RT-PCR 法Detection method for tick-borne encephalitis virus at frontier ports-Real-time fluorescence RT-PCR2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局麻 SN/T 3739—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、上海之江生物科技股份有限公司。本标准主要起草人：李智慧、詹曦菁、杨春江、杨顺义、窦勇鹰、刘阳、朱旭平、朱勤玮。I SN/T 3739—2013国境口岸森林脑炎病毒检测方法实时荧光 RT-PCR 法1 范围本标准规定了国境口岸人出境人员或蜱携带森林脑炎病毒的实时荧光RT-PCR检测，包括检测对象、标本采集和处理，检测程序，结果判定。本标准适用于国境口岸入出境人员或蜱携带森林脑炎病毒的实验室检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。人间传染的病原微生物名录（卫生部2006年）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1森林脑炎病毒tick-borne encephalitis virus俄罗斯春夏脑炎病毒‧Russianspring-summer cncephalitis virus黄病毒科黄病毒属成员，为单股正链RNA病毒，mRNA 全长 10 886bp。该病毒根据系统发生学分为欧洲亚型、远东亚型和西伯利亚亚型三个亚型。该病毒所引起的森林脑炎为一种自然疫源性疾病。本病毒的储存宿主众多，传播媒介注要为蜱，易感人群多因被携带有病毒的蜱叮咬后发病。3.2实时荧光 RT-PCR real-time RT-PCR实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和-个荧光淬灭基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR扩增时,利用 Taq 酶的5-3外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BHQ:黑洞淬灭基团（black hole quencher)Ct值：循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（cycle threshold)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)FAM:6-羧基荧光素，一种荧光报告基团(6-carboxy-fluorescein)1 SN/T 3739--2013RNA:核糖核酸(ribonucleic acid)RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction)5生物安全要求中华人民共和国卫生部发布的《人间传染的病原微生物名录》规定，森林脑炎病毒危害程度分类为第一类，所有有关森林脑炎病毒的实验室操作应按照以下规定执行：森林脑炎病毒培养和动物感染实验应在生物安全三级（BSI-3或ABSI-3)实验室内进行；未经培养的森林脑炎病毒感染性材料的操作应在生物安全三级(BSL-3)实验室内进行；-森林脑炎病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行；在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全二级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。要密切注意流行病学动态和临床表现，判断是否存在高致病性病原体，若判定为疑似高致病性病原体，应在相应生物安全级别的实验室开展工作；森林脑炎病毒感染性材料运输包装分类为A类（仅培养物为A类），UN编号为UN2814。6 对象本标准适用的检测对象为：一疑似感染森林脑炎病毒的出人境人员；一携带森林脑炎病毒的蜱。7仪器和设备本检测方法需要如下仪器设备：荧光定量PCR仪；生物安全柜；普通冰箱;-超低温冰箱（70℃）;普通台式离心机；高速冷冻离心机（转速可达13000r/min）；微量可调移液器(0.1μL-10 μl、20 μL-200 μL、1mL)及配