SN_T 3631-2013出口贝类中肠道病毒EV71的检验方法 实时荧光RT-PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3631—2013出口贝类中肠道病毒EV71的检验方法实时荧光 RT-PCR方法Detection of Enterovirus 71 in shellfish for export--Real-time fluorescence RT-PCR2013-08-30 发布2014-03-01实施中华人民共和国发布电话460215:50国家质量监督检验检疫总局段例 SN/T 3631--2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司。本标准主要起草人：曾宪东、陈建军、徐家文、肖性龙、郭明垦、赵晖、冯汉利、王振华。I SN/T 3631—2013出口贝类中肠道病毒EV71的检验方法实时荧光 RT-PCR 方法范围本标准规定了贝类中 EV71病毒的荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类中EV71 病毒的检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1肠道病毒 EV71Entero71型（简称E71），属于微小RNA肠道病毒EV71,即肠道病毒病毒科、肠道病毒属,EV71及 CoxA16型是手足口病最为常见的致病病毒。肠道病毒属包括脊髓灰质炎病毒（Poliovirus），柯萨奇病毒(Coxasckie virus)A 组 16、4、5 177、9、1Q 型和组 2、5,13 型,埃可病毒(ECHO viruses)以及肠道病毒68、69、70、71、72等血清型。3. 2荧光 RT-PCR reai-time fiorescenceRT-PCR实时荧光定量RT-PCR方法是在常规RT-PCR的基础上，加人了一条特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬衣荧光基团。探针完整时，报告基团发出的信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬火荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增条DNA链，就有个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。3.3Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4　方法概要在甘氨酸缓冲液中通过高速匀浆的物理方式对食品样品进行均质，经过温育促进病毒颗粒的释放，再利用PEG8000沉降病毒粒子。然后采用Trizol-reagent 或其他等效裂解液提取沉淀物的总 RNA，并进一步使用包被了Oligo(dT)25的磁珠与EV71病毒 RNA3’端的 Poly（A)尾巴特异性结合，纯化病毒I SN/T 3631—2013RNA。最后进行实时荧光RT-PCR扩增检测病毒核酸。5 试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。所有涉及RNA提取的试剂和器皿均经DEPC处理后高压灭菌。5.1 甘氨酸缓冲液:见附录 A中 A.1.1。5.2 PEG8000:见 A.引物和探针序列：选取EV71病毒高度保守的VP1基因为扩增反应的靶序列区域，设计引物和探针：EV71VP1F: 5-AGTGACGAGAGCATGATTGAGACACG-3EV71VP1R:5′-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3EV71VP1Probe: 5-FAM-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-TAMRA-3扩增子长度为89bp。5.4 DEPC:焦碳酸乙二酯。5.5裂解液：Trizol或其他等效产品。5.6 Oligo(dT)25磁珠。6仪器和器具6.1高速匀浆器。6.2荧光定量PCR仪。6.3生物安全柜。6.4　高速冷冻离心机。6.5 微量移液器。7检测方法7.1贝类食品样品制备7.1.1解剖,取贝类肠腺组织。7.1.2取5 g左右肠腺组织加人 35mlL甘氨酸缓冲液。7.1.3高速匀浆5min,将肠腺组织完全被打碎并与缓冲液充分混匀，将匀浆液装人50 mL离心管，250 r/min 室温振荡 30 min。7.1.4将样品匀浆液于4℃，10000g离心30min。7.1.5转移上清液至一新50mL离心管，加人等体积PEG8000溶液，颠倒混匀5次。冰上放置至少1h后，4℃放置过夜。4℃，12000g离心30min，去尽上清液，保留沉淀，4℃备用。7.2 病毒 RNA提取7.2.