SN_T 5100-2019国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS _11.020C 62SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5100--2019国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法Detection method for Kyasanur forest disease virus by real-timefluorescence RT-PCR at frontier ports2019-09-03 发布2020-03-01实施武中國海凤出版社有限公司中华人民共和国海关总署HG944440009109发布活城刮开涂层激活密码 SN/T 5100--2019前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、新疆国际旅行卫生保健中心。本标准主要起草人：马雪征、张丽萍、杨烨、胡孔新、孙肖红。I SN/T 5100--2019国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法1范围本标准规定了国境口岸卡萨诺尔森林病病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员携带卡萨诺尔森林病病毒的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用WS233病原微生物实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(原中华人民共和国卫生部令第45号)人间传染的病原微生物菌(毒)种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部令令　第68号)人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部卫科教发［200615号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1卡萨诺尔森林病病毒Kyasanur forest disease virus,KFDV属于黄病毒科的哺乳动物蜱传病毒组。注：于1957年被发现，源自印度纳塔克邦卡萨诺尔森林病死的猴子身上。自那时起，每年有 400～500个人类病例被报道。该病的症状包括高热与额叶头痛，伴有出血症状，如鼻腔出血、咽喉出血和牙龈出血，以及胃肠出血等。蜱为主要传播媒介，可引起发热、出血、肌痛和脑炎，死亡率为3%～5%，主要分布在印度西部地区。我国研究人员从1989年采集的名发热患者血清标本中分离到Nanjianyin virus，后经分子生物学等方法鉴定为KFDV的变异株,提示在我国云南横断山脉地区曾有 KFDV的发生。3.2Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BHQ1:黑洞淬灭基团(black hole quencher 1)1 SN/T 5100—2019DEPC:焦碳酸乙二酯(diethyl pyrocarbonate)FAM:6-羧基-荧光素(6-carboxy-fluorescein)5 检测对象出人境口岸发现的可疑病例。6实验室生物安全和 PCR 防污染要求6.1实验室生物安全6.1.1卡萨诺尔森林病病毒危害程度分类为第一类6.1.2实验室应遵循GB19489和WS 233，未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级（BSL-3或 ABSL-3)实验室内进行,灭活材料在生物安全I级(BSL-2)实验室内进行。6.1.3卡萨诺尔森林病病毒感染性材料运输包装分类为 A类,UN编号为 UN2814。6.1.4使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。6.1.5疑似卡萨诺尔森林病病毒材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒）种或样本运输管理规定》。6.2PCR 防污染要求按照WS/T230的规定执行。７仪器7.1实时荧光 PCR仪。7.2超净工作台。7.3二级生物安全柜。7.4高压灭菌锅。7.5·低温高速离心机：最大离心力20000g。7.6涡旋振荡器。7.7冰箱:4 ℃、-20 ℃和-70 ℃。7.8移液器:10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和 1 mL。7.9恒温水浴锅。7.10无菌注射器。8 试剂8.1核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAamp Viral RNA Kit 提取病毒核酸。8.2 实时荧光 RT-PCR 试剂:Ag-Path-IDTM One Step RT-PCR Kit。8.3无RNA酶的DEPC水。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则