NY_T 1898-2010畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程.pdf

ICS 65.020.30B 43中华人民共和国农业行业标准NY/T 1898-—2010畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程Protocol of detection for mitochondrial DNA genetic diversityof domestic animals2010-07-08 发布2010-09-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1898—2010前言本标准遵照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：全国畜牧总站。本标准主要起草人：王志刚、刘丑生、邱小田、张桂香、韩旭、于福清、孙飞舟。I NY/T 1898—2010畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程1 范围本标准规定了畜禽线粒体DNA遗传多样性检测的技术规程。本标准适用于畜禽线粒体 DNA遗传多样性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文本的应用是必不可少的。凡是注日期的弓用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GA/T 383法庭科学 DNA实验室检验规范NY/T 1673畜禽微卫星 DNA遗传多样性检测技术规程3 术语和定义下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3. 1线粒体 DNA mitochondrial DNA,mtDNA动物细胞核外唯一具有半自主能力的双链环状 DNA。3. 2线粒体 DNA D~ loop 区mt DNA D- loop动物线粒体DNA翻译和转录的调控区和唯一的非编码区，当线粒体DNA 开始复制时，此区外形呈D形。4检测方法4.1样品的采集和保存4.1.1在中心产区采样，个体应具备该种群的典型特征，样品的采集及保存应满足提取DNA的要求，并详细记录材料名称、来源、系谱、采集时间、地点及保存条件。4.1.2每种群采集畜禽个体一般不少于60头（只）,其中雄性数量不少于10%,要求个体间三代内无血缘关系。4.2DNA的制备制备DNA的方法按NY/T1673的规定执行。4.3引物制备4.3.1引物合成根据相关畜禽线粒体基因组序列设计引物，并合成。4.3.2工作液配制将合成的引物瞬时离心，加入灭菌超纯水充分震荡，配成浓度为100 pmol/μL的储液，室温溶解30min，分装，一20℃保存，储液稀释10 倍即为工作液。其中加人灭菌超纯水的体积V(μL)按式(1)计算：V = 33 XOD × 10%(1)MW1 NY/T 1898—2010式中:MW——引物分子量;OD——DNA260 nm吸收的光密度。4. 4 PCR 反应体系PCR反应体系见附录 A.1。4.5PCR反应程序PCR反应程序见附录 A.2。扩增产物的检测与回收4.6凝胶电泳法检测PCR产物，扩增效果良好的样品按附录B纯化回收，按附录C测序。5数据分析序列比对、单倍型统计、系统发生树构建等数据分析参见附录D。0防污染措施按GA/T383规定的方法执行。7 对照实验设立阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照为线粒体DNA样品，阴性对照为不具有细胞核DNA样品，空白对照为等量双蒸水。2 NY/T 1898—2010附录A(规范性附录)PCR 反应体系和程序A. 1 PCR 反应体系见表 A. 1表A.1PCR 反应体系组分及浓度使用量Buffer(10 X)5. 0 μLMgCl2 (25 mmol/ L)1 μL~4 μL2. 0 μL引物 P1A(10 pmol/ μL)2. 0 μL引物 P1B(10 pmol/ μL)dNTPs(10 mmol/ L)1 μLTaq E(5 U/ μL)0. 2 μLDNA样品 50 ng~100 ngddH,0加至 50 μLA.2 PCR 反应程序见表 A.2表 A. 2PCR 反应程序阶段温度,℃时间预变性954 min9420 s~60 s50～6525个～35个循环30 s~60 s7230 s~90 s延伸72℃ 10 min~70 min保存4℃3 NY/T 1898—2010附录B(资料性附录)扩增产物的纯化回收B.1材料、试剂和仪器B.1.1 材料待回收DNA样品。B. 1.2 试剂a）1%低熔点胶,琼脂糖;glassmilk kit:裂解缓冲液,漂洗液，glassmilk;b)TE,ddH,O;c)d)é酚:分析纯;e)氯仿：分析纯；f):无水乙醇：分析纯；g）70%乙醇：分析纯。B. 1. 31仪器设备a）离心机;b）水浴锅;c）电泳仪。B.2纯化回收程序B.2.1低熔点胶法电泳到适当位置后，在目的DNA条带的前端挖一长方形槽，向槽中加人融化的低熔点胶，待凝固后进行电泳。当DNA进入低熔点胶中心时停止电泳